DNA的琼脂糖凝胶电泳实验

DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。

电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电，在电场中向正极移动，且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，能以相同速率移动。通常，DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少，与电场强度成正比。

分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时收到较大阻力，依此分离不同大小的DNA片段。一般，DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段，视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。

DNA片段

琼脂糖电泳缓冲液（1XTAE或0.5XTBE）载样缓冲液荧光插入染料（溴化乙锭或SYBR Gold）DNA大小标准品（DNA Marker）

琼脂糖凝胶电泳仪紫外透射仪或紫外凝胶成像仪微波炉移液器水浴锅

1.  用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

2.  调整好梳子的高度；

3.  称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50篊时倒入制胶板中；

4.  凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

5.  将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；

pUC185祃+ddH₂O₃祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样；

6.  将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

7.  电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5礸/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

1.  影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

（1）DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）

（2）胶浓度，U为迁移率，U0t 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率，
 

（3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

（4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5 V/cm

（5）碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃

（6）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)

（7）电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2.  溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3.  电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

常见问题原因分析

1. 跑出的DNA带模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）电泳缓冲液不新鲜：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

（3）所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

（4）DNA上样量过多：减少凝胶中的DNA上样量。

（5）DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

（6）有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2. 有不规则DNA带迁移？

（1）对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

（2）电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

3. 跑出的DNA条带弱或无条带？

（1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝胶：正确连接电极方向避免插反的情况，缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

（4）所用光源不合适：对于用EB染色的DNA应用短波长（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA带缺失不完整？

（1）如果是小DNA带，可能跑出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

（2）分子大小相近的DNA带不易分辨，应延长电泳时间，并核准正确的凝胶浓度。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

实验方法出处来源《分子克隆实验指南