DNA甲基化检测技术全攻略

• 近年来涌现出不少 DNA 甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析 (methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。

特异位点的甲基化检测

甲基化特异性 PCR (MS-PCR)

这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展 MS-PCR。在传统的 MSP 方法中，通常设计两对引物 ，一对 MSP 引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的 DNA 模板，而另一对扩增未甲基化片段。

若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。

这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的 DNA 序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。

亚硫酸氢盐处理+测序

这种方法一度被认为是 DNA 甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用 PCR 扩增目的片段，并对 PCR 产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断 CpG 位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。

联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)

DNA 样本经亚硫酸氢盐处理后，利用 PCR 扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶 (BstUI) 消化。

若其识别序列中的 C 发生完全甲基化 (5mCG5mCG)，则 PCR 扩增后保留为 CGCG，BstU I 能够识别并进行切割; 若待测序列中，C 未发生甲基化，则 PCR 后转变为 TGTG，BstUI 识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。

这种方法相对简单，可快速定量几个已知 CpG 位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品 DNA 中存在甲基化的可能。

荧光定量法(Methylight)

此种方法利用 TaqMan® 探针和 PCR 引物来区分甲基化和未甲基化的 DNA。首先用亚硫酸氢盐处理 DNA 片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量 PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在 PCR 后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。

Qiagen 就提供了多种预制的 MethyLight 分析。EpiTect MethyLight PCR Kit 包括了两条甲基化敏感的 TaqMan 探针和 2 条甲基化不敏感的 PCR 引物。

随着目标序列甲基化状态的不同，只有 FAM 标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化 DNA 特异的 TaqMan 探针，或只有 VIC 标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的 DNA 特异的 TaqMan 探针能与目标序列杂交。如果探针与 DNA 杂交则释放出荧光信号。信号强度与 PCR 产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析

亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化 DNA 会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现，因为甲基化 DNA 含有更多的 GC，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化，可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解 (HRM) 技术可检出极微小的差别。

使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高，需要带 HRM 模块的荧光定量 PCR 仪。目前市场上有多款 PCR 仪可满足要求，包括 Illumina 的 Eco、QIAGEN 的 Rotor-Gene Q、罗氏 LightCycler 480 等。

焦磷酸测序

焦磷酸测序技术 (Pyrosequencing) 作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。

通过准确定量单个连续的 CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据 C 和 T 的掺入量来定量确定单个位点的 C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

QIAGEN 目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24 的强项在于可对多达 24 个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在 PyroMark Q96 ID 上进行。

在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而 PyroMark Q96 MD 装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的 DNA 模板进行准确测序。

为配合焦磷酸测序，QIAGEN 还推出了 PyroMark CpG Assays。这些预设计的甲基化分析使用特别定制的算法来设计出焦磷酸分析所用的 PCR 和测序引物，从而实现了基因组内特异靶点的甲基化分析。

基于芯片的甲基化图谱分析

就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多个公司都提供了这种工具，包括安捷伦的 Human CpG Island Microarray Kit，Illumina 的 HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen 的 Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array 和 Affymetrix 的 seven-array GeneChip® Human Tiling 2.0R Array Set。

平台不同，过程也各异。安捷伦和 NimbleGen 的分析过程中，基因组 DNA 分成两份，一份用来做 MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光 (富集的样品用 Cy5 标记，对照用 Cy3 标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的 Cy5/Cy3 强度比例显示出该区域的甲基化程度。

安捷伦的 244,000-element array 覆盖了 27000 多个人 CpG 岛和甲基化不足区域 (UMR)。NimbleGen 的 Human 2.1M Deluxe Promoter array 也覆盖了 27000 多个 CpG 岛，还包括了 27000 多个启动子区域，所有这些都是以 100 bp 的分辨率。然而这两个平台都不能以单核苷酸的分辨率报告甲基化状态，但是 Illumina 的 Infinium 和 GoldenGate 分析做得到。

Illumina 的 Infinium HumanMethylation27 BeadChip 芯片覆盖 27,578 个 CpG 位点。分析利用两个位点特异的探针拷问这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点 (M 磁珠类型) 设计的，而另一个是为未甲基化位点 (U 磁珠类型) 设计的。

探针的单碱基延伸掺入了一个标记的 ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定拷问位点的甲基化水平。

此产品虽评价颇高，可惜目前已停产，取而代之的是 Infinium HumanMethylation450 BeadChip 芯片。它以单碱基分辨率覆盖了每个样品中超过 45 万个甲基化位点，实现了基因区域和 CpG 岛的全面覆盖。

此外，还附加了甲基化专家所精选的高价值内容，包括 CpG 岛之外的 CpG 位点，在人类干细胞中鉴定出的非 CpG 甲基化位点，以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为筛选 GWAS 群体的理想选择。索取 HumanMethylation450 BeadChip 芯片的更多资料

相比之下，VeraCode GoldenGate 甲基化分析更适合高通量的验证研究，它以溶液的形式分析 48 至 384 个用户指定的 CpG 位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组 DNA 与分析 oligo 混合，oligo 与未甲基化位点的 U 互补，或者与甲基化位点的 C 互补。

杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的 oligo 来产生通用 PCR 的模板。最后，用标记的 PCR 引物生成可检测的产物。据 Illumina 的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个 CpG 位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过 Illumina 分析，你能精确测定某个 CpG 位点的甲基化水平。索取 GoldenGate 甲基化分析的更多资料

高通量测序

新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组 (methylome) 的研究成为可能。近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具 (如 DNA 的亚硫酸氢盐转化) 与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。

而第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前，美国 Pacific Biosciences 公司利用独有的单分子实时 (SMRT) 测序技术，直接测定了 DNA 的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。

SMRT 技术采用的是对 DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA 聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。

当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测 DNA 模板链中的修饰核苷酸，包括 N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶。

研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合 circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰 (mA、mC 和 hmC)。

飞行质谱

美国 Sequenom 公司的 MassARRAY® 平台也可用于 DNA 甲基化分析。MassARRAY® EpiTYPER™ DNA 甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和 MALDI-TOF 检测原理，可实现多重 CpG 的分析检测。

碱基特异性酶切 (MassCLEAVE) 实验由亚硫酸氢盐处理待测 DNA 开始。经过亚硫酸氢盐处理，DNA 中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶 (U)，由此在 DNA 模板中产生甲基化特异的序列变化。

利用 5' 末端带有 T7-启动子的引物进行 PCR 扩增，产物经 SAP (虾碱性磷酸酶) 处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后 DNA 片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件 EpiTYPER 则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。

MassARRAY 甲基化检测无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达 500 bp 的多个 CpG 位点，且灵敏度高，可检测低至 5% 的甲基化水平。目前有多家公司提供 MassARRAY 甲基化检测服务，如北京毅新兴业。