DNA纯化实验

实验方法原理

硅胶膜可在高盐条件下结合DNA，又可在低盐条件下与DNA分离。用于清洁目的的含DNA溶液中的引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等杂质因为没有与DNA相似的特性，所以被分离开来。

实验材料 PCR产物

试剂、试剂盒 PCR清洁试剂盒

仪器、耗材 96孔DNA制备板96孔深孔板96孔V型底板

实验步骤

一、试剂盒组成、贮存、稳定性

1.   说明书，耗材：96孔DNA制备板，96孔1.6 ml深孔板，96孔V型底板。

2.  Buffer PCR-A：DNA结合溶液。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于65°C温浴溶解并冷却至室温后再使用。

3.  Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%无水乙醇。

4.  Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5。室温密闭贮存。

二、操作步骤

用户可以选择负压法或离心法。

A. 负压法

1A.  正确连接负压装置，将96孔DNA制备板置于负压装置上；在PCR、酶切、酶标或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A（若Buffer PCR-A不足100 μl，加至100 μl）；混合均匀后转移到96孔DNA制备板中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸掉板中溶液。

2A.  加0.3 ml Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.3 ml Buffer W2洗涤两次。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

3A.  保持负压将96孔DNA制备板抽吸10 min。

4A.  导流管朝下将96孔DNA制备板于长纤维性纸巾上用力拍击6次。

5A.  将96孔DNA制备板置于96孔V型底板上，在膜正中央加25-30 μl水或Eluent，室温静置1 min。≥3 000×g离心5 min洗脱DNA。

B. 离心法

1B.  在PCR、酶切、酶标或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A（若Buffer PCR-A不足100 μl，加至100 μl）；混匀后，转移到96孔DNA制备板中，将96孔DNA制备板置于96孔1.6 ml深孔板中，1 000×g离心1 min，弃滤液。

2B.  在96孔DNA制备板中，加0.3 ml Buffer W2，1 000×g离心1 min，弃滤液。以同样的方法再用0.3 ml Buffer W2洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

3B.  将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中，≥3 000×g离心10 min。

4B.  将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板中，在膜正中央加25-30 μl水或Eluent，室温静置1 min。≥3 000×g离心5 min洗脱DNA。

注意事项

1.   将洗脱液或水加热至65°C，有利于提高洗脱效率。

2.  DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH8.5洗脱液中保存。