DNA自动序列测定试验

[实验原理]
DNA 测序（DNA sequencing）是对DNA 分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA 的复制反应体系中需要存在DNA 聚合酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH 末端。然而，如果在DNA 合成体系中加入双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP），后者与dNTP 的区别在于脱氧核糖的C3 位置缺少-OH，这样，一旦2’,3’-ddNTP 掺入到DNA 链中，由于没有3’-OH，不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的引物链在此终止。
DNA 自动测序技术也采用了这一基本原理。即在反应体系中除了加入正常反应所必需的4 种dNTP 外，还加入了一定比例的4 种荧光染料基团标记的2’,3’-ddNTP，链合成过程中，dNTP 和荧光染料基团标记的2’,3’-ddNTP 处于一种竞争状态，结果DNA 合成反应的产物是一系列长度不等的具有荧光信号的多核苷酸片段，借助计算机自动数据处理最终得到 DNA 碱基的排列顺序。
[试剂与仪器]
试剂：1. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit:
⑴ Ready Reaction Mix; ⑵ 阳性对照模板和引物; ⑶ BigDye Terminator v3.1Sequencing Buffer (5×)。
2. 目的基因测序引物。
3. 100%乙醇；125mM 的EDTA；3M 醋酸钠（pH 5.2）；70%乙醇。
4. Hi-Di 甲酰胺。
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
仪器：1. MicroAmp® 96-Well Reaction Plate；
2. PCR 扩增仪（GeneAmp PCR System 9700）；
3. 低温高速离心机；
4. DNA 序列分析仪（ABI 公司3130 基因分析仪）。
[操作方法]
1. 模板的准备（PCR 扩增产物）
⑴ 目的基因的扩增与纯化：
一般来说，任何可以去除dNTPs 和引物的方法都是可行的。这里推荐使用Microcon-PCR单个样品PCR 产物纯化柱（Millipore, #1045062）。
⑵ 确定PCR 扩增并纯化后的目的基因的质量：
应用琼脂糖凝胶电泳法检测纯化后目的基因的质和量。对测序用PCR 产物的量的要求见下表。
PCR 产物 应用量
100–200 bp 1-3 ng
200–500 bp 3-10 ng
500-1000 bp 5-20 ng
1000-2000 bp 10-40 ng
>2000 bp 20-50 ng
2. 测序反应
⑴ 测序反应混合物的准备：按下列比例配制。
Ready Reaction Premix (2.5×) 2μl
BigDye Sequencing Buffer (5×) 1μl
引物 3.2 pmol
模板 见PCR 产物应用量
去离子水 至10μl
总体积 10μl
⑵ 测序反应的条件：
96℃1min→（96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min）×25 循环→4℃ 保温
3. 测序反应后产物的纯化
应用乙醇/EDTA/醋酸钠法对测序反应后产物进行纯化。具体方法为：
⑴按顺序直接向每个测序反应体系中加入1μl 的125mM 的EDTA，1μl 的3M 醋酸钠和25μl的100%的乙醇，充分混匀；
⑵室温孵育15min 后，4℃条件下，14000rpm，离心15min；
⑶小心去除液体部分后，向每个测序反应体系中加入70μl 的70%的乙醇；
⑷4℃条件下，14000rpm，离心8min；
⑸小心去除液体部分，干燥后备检。
4. 制备3130 测序电泳样品
直接向纯化后的样品管中加入10μl 的Hi-Di 甲酰胺，95℃变性3min→迅速冰冷3min。
然后将样品放入3130 样品载样盘上，备检。
5. 3130 电泳操作：见如下所列电泳参数。
6. Data Collection v2.0 软件操作：
①新建Instrument Protocol：在Data Collection v2.0 软件的树形浏览窗依次点击GAInstruments > ga3100 / ga3100-Avant > Protocol Manager；在Instrument Protocol 窗口点New 打开Protocol Editor 对话框；完成编辑：输入一个名字；在Type 下拉菜单选择REGULAR；在Run Module 下拉菜单选择HIDFragmentAnalysis36_POP4_1；在Dye Set下拉菜单选择G5。OK。
②新建Results Group：在Data Collection v2.0 软件的树形浏览窗依次点击GA Instruments> Results Group；点New 打开Results Group Editor 对话框；在General tab 输入名字；在Analysis tab 设置自动分析；在Destination tab 设置数据保存路径；在Naming tab 设置数据文件和文件夹名称；在Automated Processing tab 设置数据自动处理方式。OK。

③新建GeneMapper ID Software Plate Record 用于自动分析：在Data Collection v2.0 软件的树形浏览窗依次点击GA Instruments > ga3100 / ga3100-Avant > Plate Manager；完成New Plate 对话设置：名称，在Application 下拉菜单选择GeneMapper-Generic(手工分析)或者GeneMapper-<Instrument name>(自动分析)，输入板型、操作者名称等，OK，打开编辑窗口，完成样品表(Plate Record)。将样品板组装好，放到3100 上；找到Plate Record并选中它，然后点击对应样品板的plate position indicator，点击RUN 按钮开始电泳。
[结果判断]
全自动DNA测序工作站会自动地完成对样品DNA的碱基序列分析，然后把分析完成后的结果数据以样品文件的形式保存于计算机的硬盘中。分析好的样品文件可以用序列分析软件来打开查看结果。电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度，图上不同颜色的信号代表了四种不同的碱基，图中的每个峰代表一个DNA片段。