DNA连接酶及其应用

（一）DNA连接酶的发现

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。

1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。

（二） DNA连接酶作用特点

1. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；

2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。

E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。

T 4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。

（三） DNA连接酶的反应条件

影响连接效率的因素有：

1. 温度（通常在4-15℃ ）

2. ATP的浓度(10μM／L - 1mM／L )

3. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）

4. 反应时间（通常连接过夜）

5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1）

（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案

1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。

3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。