DNA重组（DNArecombination）技术：DNA重组的载体1

载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。

载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。

一、质粒载体

质粒是细菌染色体以外具有自主复制能力的小型双链环状DNA分子。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和 pSC101等。鉴于天然质粒作为克隆载体存在着不同程度的局限性，各实验室便对其进行修饰改造，并逐步完善。依复制是否受宿主细胞蛋白质合成控制分紧密型质粒（stringent plasmid）和松驰型质粒（relaxed plasmid）。质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成。这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制至上千个拷贝。利用这一原理，在质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，达到进一步扩增质粒的目的。

一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。④分子量相对较小和较高的拷贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。

下面介绍几种有代表性的质粒载体。

㈠ pBR332质粒载体

pBR332质粒就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR332是最早被广泛应用于分子克隆的载体之一，至今尚在使用。pBR332的结构如图7-1所示，是研究得最清楚的质粒，为一个4.36kb的环状双链DNA。pBR332由三个不同来源的部分组成：①来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori）；②来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr；③来源于pSC101质粒的Tetr。

pBR332质粒载体具有下述特点：

1．带有一个复制起始位点 保证该质粒能在大肠杆菌中复制。

2．具有二个抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记和数个单一的限制性酶切位点 其中三个单一的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ均在Tetr基因内，PstⅠ识别位点在Ampr基因内。当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活。

3．具有较小的分子量 pBR332质粒载体的这种小分子量特征，不仅易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。

4．具有较高的拷贝数 而且经氯霉素扩增后，每个细胞可累积1 000~3 000个拷贝，这为重组DNA的制备提供了极大的方便。

㈡ pUC质粒载体系列

pUC质粒是在pBR332基础上改建而成的。它们保留了pBR332的一部分，组入了一个来自M13噬菌体在其5′-端带有一段多克隆位点的LacZ′基因，而发展成为具有双重检测特征的新型质粒载体系列。一个典型的pUC系列的质粒载体包含如下4个组成部分：①来自pBR332 质粒的复制起始位点（ori）；②Ampr基因，但其DNA序列已不再含有原来的核酸内切酶单一识别位点；③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构称为LacZ′基因；④位于LacZ′基因中靠近5′-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能。

pUC系列的多克隆位点一一对应于M13mp系列。PUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19，即每对间含有大致相同的多克隆位点（个别切口又可不同），但整个多克隆位点反向倒装（故称其为一对）。不同对的pUC系列质粒载体的多克隆位点的数目和种类不同。

与pBR332质粒载体相比，pUC系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点有：①具有更小的分子量和更高的拷贝数，在构建pUC系列时仅保留了pBR332的复制子和Ampr；②适应于组织化学筛选重组体，pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ′基因，其编码的α-肽链可参与α-互补作用。目的基因插入后，破坏LacZ基因的完整性。在重组实验中，可用异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTC）诱导LacZ基因表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，该酶能消化5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖（X-gal）产生蓝色产物。若LacZ基因插入失活，则缺乏β-半乳糖苷酶表达，也就不能消化X-gal，菌落为白色即阳性重组体克隆，此称作蓝白斑实验；③pUC系列的多克隆位点与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在二类载体系列之间来回“穿梭”，这使克隆序列的测序极为方便。