试剂、试剂盒 ATP[y-32P]ATPT4多核苷酸激酶乙酸铵乙醇酚 氯仿氯仿 异戊醇NaOAcT4 DNA连接酶酚异丙醇重蒸水Sepharose CL-2B溴化氰NN-二甲基甲酰胺NaOH磷酸钾KClCNBr-活化的Sepharose*.4BHClT4 多核苷酸激酶缓冲液TE接头-激酶缓冲液乙醇胺-HCl层析柱的储存缓冲液
仪器、耗材 SpeedVec 旋转浓缩器
实验步骤
材料与设备
ATP(20 mmol/L;pH7.0)
[y-32P]ATP(5uCi)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸铵 (10mol/L)
乙醇（100% 及 75%;v/v)
酚/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
NaOAc(3mol/L)
T4 DNA 连接酶（Stratagene)
酚（经 TE 平衡）
异丙醇（2-丙醇）
重蒸水
Sepharose CL-2B(pharmacia Biotech,Inc.)
溴化氰（CNBr)(Aldrich Chemical Co.,C9149-2)
N，N-二甲基甲酰胺
NaOH(5mol/L)
磷酸钾（lOmmol/L 及 lmol/Lt 均为 pH8.0)
KCl(1mol/L)
CNBr-活化的 Sepharose*.4B(Pharmacia Biotech,Inc.)
HCl(1 mmol/L)
SpeedVec 旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)
试剂
T4 多核苷酸激酶缓冲液（10X)
TE
接头-激酶缓冲液（10x)
乙醇胺-HCl (1mol/L;pH8.0)〔用 HC1 将 1mol/L 乙醇胺 (游离碱) 调至 pH8.0〕
层析柱的储存缓冲液
(配方，见"试剂的配制"，P.131—138)
操作程序
寡核苷酸的 5'-磷酸化
1）配成下列反应混合物：
DNA(溶于 TE 的每份寡核苷酸为 440ug；即总 DNA880ug）65ul
T4 聚核苷酸激酶缓冲液（10X)10ul
总体积：75ul
2) 互补 DNA 双链变性后再退火：88°C 孵育 2 min，65°C 孵育 10 min,37°C 孵育 10 min，最后室温解育 5 min。
3) 合并下列溶液：
DNA(由上步得到）75ul
ATP(20 mml/L;pH7.0；含约 5uCi[γ-32P]ATP)15ul
T4 多核苷酸激酶 (100U)10ul
总体积：100ul
4)37°C 孵育 2 h, 加 50ul 10mol/L 乙酸铵及 100ul H20, 使终体积达 250ul。
5)65°C 加热 15 min, 使激酶失活。
6) 混合物降至室温。加 750ul 100% 乙醇，颠倒混勻。用微型离心机于室温下髙速离心 15 min, 沉淀 DNA。
7) 弃上清，加 225ulTE, 震荡，溶解沉淀 c
8) 加 250u1 1:1 的酚/氯仿，震荡混合 1 min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
9) 将上层液体转移至一新管，加 250ul 24:1 氯仿/异戊醇，震荡混合 1min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
10) 将上层转移至一新管中，加 25ul 3mol/LNaOAc，震荡混合。
11) 加 750ul 100% 乙醇，颠倒混匀，高速离心 15 min, 沉淀 DNA。
12) 弃上清，加 800ul 75% 乙醇，震荡混合，高速离心 5 min。
13) 弃上清，SpeedVac 旋转浓缩器干燥。