DNA和RNA定量利器：Qubit4

新一代测序（NGS）实验中，我们需要将精确量的DNA文库分子上样到测序仪中。如果测序运行时的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损。这不仅浪费宝贵的样本和试剂，也浪费我们和仪器的时间。对于芯片分析（Microarray）和实时定量PCR（qPCR）而言，精确测定样本中的DNA或RNA也是必需的。

以往我们大多采用分光光度计来测定260 nm处的吸光度，对DNA和RNA进行定量。尽管这种方法被广泛采用，但并不意味着它的读数是准确而可靠的。紫外吸光度测量不具有选择性，无法区分DNA、RNA或蛋白质。而一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。

Qubit 4荧光定量仪Life Technologies（赛默飞世尔旗下）的qubit 4荧光定量仪正是基于此原理工作的。它采用荧光染料与特异的靶分子结合。只有当荧光染料与样本中的特异分子（DNA或RNA或蛋白质）结合时，才会发出荧光信号，从而大大提升了研究的准确性。并不是要推qubit 4荧光定量仪，而是Qubit 4的精准、灵敏等性能满足了新一代测序（NGS）实验。也就是说qubit 4的诞生是必然的，qubit 4荧光定量仪的与时俱进让它在新一代测序（NGS）实验中成为佼佼者，qubit 4时代已经到来！

DNA或RNA的选择性PK

研究人员曾经做过实验，使用DNA和RNA含量相同的样本，利用qubit® dsDNA BR 分析试剂盒测定其中DNA的浓度，结果发现测量结果在实际含量的的±2%范围内，足以证明qubit®的厉害。之后，他们使用了RNA含量比DNA高10倍的样本，发现测得的DNA浓度仅比实际值高7%。再来看看分光光度计的表现吧。研究人员发现它们无法准确测定上述样本中DNA和RNA的含量（图下图）。好吧，第一回合qubit® 获胜。

上图中，用qubit® dsDNA BR和qubit® RNA BR分析试剂盒及qubit®荧光计，按照试剂盒实验方案检测含有lamBDa DNA (10 ng/μL)和不同量的大肠杆菌核糖体RNA (0-100 ng/μL)的样本，每个样品重复3次。然后采用NanoDrop® ND-1000分光光度计检测同一样本三次，采用Perkinelmer® LamBDa 35分光光度计检测一次。标示的浓度是在qubit®分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA和RNA的实际含量。

低浓度下的准确性PK

研究人员之后采用qubit® dsDNA HS分析试剂盒及qubit® 荧光计，定量浓度仅为10 pg/μL的样本中的DNA，发现测得值在实际值的±12%范围内。而采用分光光度计测量上述相同样本，测得的浓度比实际值高46倍。而对于10 ng/μL的样本，qubit® 测得值在实际值的±1%范围内，而分光光度计测定的浓度在实际值的±5%范围内（如图）。显然，在样本浓度低的情况下，使用qubit® 更为合适。

上图中. qubit® 荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案，在qubit® 荧光计中采用qubit® dsDNA HS分析试剂盒重复10次测量浓度在0.01至10 ng/μL之间的lamBDa DNA。同时采用NanoDrop® ND-1000分光光度计重复10次测量相同浓度的DNA，比较结果的准确度(A) 和精度(B)。

样本浓度范围PK

 qubit 的配套试剂盒有很多种，分别适合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白质。其中，双链DNA分析试剂盒又分为高灵敏度（HS）和宽范围（BR）两种，适合10 pg/μL至1 μg/μL的DNA。与之类似，qubit RNA HS和BR分析试剂盒覆盖的样本浓度范围在250 pg/μL至1 μg/μL。而分光光度计的检测范围通常在2 ng//μL至15 μg/μL（如图）。由此可见，qubit 适合的浓度范围更宽，不过，高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。 

上图中. qubit®分析与采用NanoDrop®分光光度计进行紫外吸光度检测的样本浓度范围比较

其他方面PK

当然，分光光度计也有它的优势。全光谱吸光度读数可以通过吸收峰显示是否有污染物存在。另外，它的使用成本较低，上样、测定、擦拭即可，几乎不需要消耗品。而qubit® 则需要购买配套的分析试剂盒。

想必大家还对第一代的qubit® 荧光定量仪记忆犹新，活脱脱一个复活节的彩蛋嘛。如今，qubit® 已经升级到3.0的版本，虽然没有之前那么萌，但易用程度再次升级。5.7英寸的彩色触摸屏方便设置和使用，更有多种操作语言供你灵活选择。全新的荧光计模式，使得您可以获得每个样本的原始荧光数据（RFU），配合Myqubit在线工具可以创建新的分析类型，不断扩展您的应用范围。qubit® 3.0荧光定量仪采用强大的双核处理器，5秒内快速准确地定量DNA、RNA和蛋白。大尺寸的彩色触摸屏和Android系统，使得操作非常简单直观。浓度计算和设置都由仪器自动完成。若样本浓度处于延伸范围或超出范围，屏幕上均会有图形显示。

测量工作也很简单，所有qubit® 试剂盒均采用相同的操作方案，只是孵育和读数稍有差异。其中DNA和RNA分析试剂盒仅需孵育2分钟，而蛋白分析试剂盒需要15分钟。1-20 μL样本均可使用。qubit® 最多可储存1000个样本结果，您可以通过U盘导出，也可以使用USB连接线直接与电脑相连。

如今，Life Technologies提供单台qubit® 荧光定量仪、起始套装（包括四种分析试剂盒）以及NGS起始套装，供您选择。