EB病毒转化成淋巴细胞实验

实验概要

本实验介绍了EB病毒转化为淋巴细胞的方法。

实验材料

1. 感染性EB病毒通常取自绢猴细胞系B95-8的限制培养基。该细胞系源于EB病毒感染的绢猴外周淋巴细胞，产生高滴度感染病毒。

2. 全血

实验步骤

1. 混合10ml全血和10ml RPMI 1640 生长培养基
生长培养基
RPMI 1640 800ml
FBS 200ml
2mmol/L L-谷氨酰胺
5μg/ml 两性霉素
50μg/ml 庆大霉素

2. 取15ml无菌离心管，加3ml Histo-paque1077（Sigma），在其上加4ml稀释血，分离淋巴细胞。
3. 室温300g 离心30min，弃上层清亮血浆。
4. 收集不透明的淋巴细胞层，细胞悬液倒入50ml无菌离心管。
5. 20ml RPMI 1640生长培养基洗2次，室温300g离心10min。
6. 10ml血锋利的细胞悬于1.0ml含EB病毒的上清。含EB病毒上清来自绢猴细胞系B95-8（ATCC提供）的限制培养基，含EB病毒的B95-8限制培养基用前应过滤[(0.22μm无菌滤膜（Corning）]，避免污染绢猴细胞。
B95-8绢猴细胞产生高滴度感染性EB病毒，应在P2实验室中作为生物毒剂操作。高密度绢猴细胞不更换或补加培养液温育8天，收集上清，0.22μm无菌滤膜过滤，用于无限增殖的话，含EB病毒限制培养液4℃可贮存4-8周。
7. 细胞悬液（1.0ml）放入25cm²组织培养瓶，垂直放置，37℃ 5% CO₂孵育1~3h。
8. 孵育后，加入3ml含0.2μg/ml 刀豆凝集素A的RPMI 1640生长培养基，水平放置，使细胞均匀分布于全生桌面。隔几天观察一次细胞生长状况，集落的形成标志着细胞已无限增殖化。
9. 每周加1ml含刀豆凝集素A的新鲜RPMI 1640生长培养基，不要吸出原培养基。