ELISA试验中常出现问题及解决办法

  ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。除了盒子本身质量外，操作中很多因素都影响试验的正常结果。zui常出现的问题是显色淡，灵敏度偏低、重复性不佳、假阳性结果和假阴性结果，不管出现什么样的结果，不但浪费客户的金钱、样本、精力，更重要的是对临床做出了危险判断。在这里我们分析ELISA试验非正常检测结果产生的常见原因，并探讨其解决办法，以提高检测质量。

一、显色淡，灵敏度偏低

1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高；所以尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温

2、试剂盒未充分平衡；所以试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。

3、培养箱温度不足37℃，应注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意。

4、保温时间不足；所以做实验时一定注意时间的重要性，如果怕忘了时间，可以校正定时钟准确定时。

5、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加；按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数

6、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁；所以保证校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，一次性使用。

7、蒸馏水水质有问题，要使用新鲜合格的蒸馏水。

二、重复性较差，经常有客户反馈说做了两个复孔值相差太大。可能的问题有：

 1、样品数量多少不一，加样时间有长有短；所以重复某一样品时，加样时间尽可能与*次接近。

 2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。

 3、加样量不一致；样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。

三、假阳性结果和假阴性结果

1、标本的采集与保存

1.1当标本采集保存不当产生溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，其通过吸附或“PP效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B液显色而造成假阳性

1.2标本采集保存不当致细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，会产生假阳性反应；标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，易使间接法的试验本底加深。因此，标本宜在新鲜时检测。

1.3反复冻融血清会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量分装冻存。

2、加样

2.1如果 样品稀释液少加或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占IgG的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异性IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异性的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，极易造成高值阴性。反之，造成假阴性。

2.2  如果加入的酶结合物过多或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。

2.3如果血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心分离血清，此时的血清中仍留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。

3.  温育

3.1  由于ELISA试验在一定温度下的反应时间并不是反应的终点，温育时间过短、温度过低，易致显色不全；温育时间过长、温度过高，易致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，产生阴性高值或假阳性反应。因此，要严格按规定的温度和温育时间进行。

3.2  由于水浴较难将温度控制在稳定的范围，因此我们每次试验时应认真观察水浴箱的温度，尽量少开启水浴箱门，严格控制水浴的温度为37±0.5。同时，微孔板不可重叠放置，以保证传热均匀，各板的温度都能迅速达到平衡。

3.3  由于试剂盒通常设定的反应温度为37度，在这个温度下温育一定时间，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断地增加，这样必会导致反应zui后的值升高。因此温育时应贴上封板胶。

4.  洗板

    洗板在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却是决定试验成败的关键。ELISA就是靠洗板来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，通过洗板以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗板时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在ELISA操作中，洗涤是zui主要的关键技术，应严格按要求洗涤。洗板如不彻底，有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标记抗体作用而产生干扰。

4.1  各厂家的洗液是根据各自试剂的条件配制的，因此采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底升高，所以不同厂家的洗液不应混用。

4.2  洗液应按规定的倍数稀释使用。试剂盒提供的洗液是浓缩的，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底升高。反之造成假阴性。

4.3  稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.5us/cm。如果水中含有过多的钙、镁离子，这些离子会占用表面活性剂，使试验本底增高。