FarWestern分析蛋白质相互作用实验

实验方法原理

实验材料 待分析的样品编码目的蛋白的 cDNA（已经克隆到体外表达载体中）

试剂、试剂盒 1 × SDS 上样缓冲液丽春红 S 染液封闭缓冲液 I封闭缓冲液 II体外转录 翻译试剂盒PBS35S-甲硫氨酸探针纯化缓冲液探针稀释缓冲液

仪器、耗材 微量过滤离心柱聚偏氟乙烯（PVDF）／硝化纤维膜（NC）

实验步骤

封闭缓冲液 I： 0.05%（m/V）吐温-20 溶解到 1 × PBS 缓冲液中，新鲜配置

封闭缓冲液 II： 1 g 牛血清白蛋白（BSA；fraction V）溶解到 100 ml 1 × PBS ，新鲜配置

1. 准备待分析蛋白样品，将之融解到 1 × SDS 上样缓冲液中。

2. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本。

3. 用半干印迹法将蛋白质从胶上转到固体支持膜上（如 PVDF 或者硝化纤维膜））。

4. 可选步骤：转膜后，用 100 ml 新鲜稀释的 1 × 丽春红 S 染液染膜 5 min。染膜时要用能够容纳膜的足够大的容器，足够多的丽春红 S 染液，能够完全没过膜表面。

5. 褪色：使用去离子水洗膜数次直至蛋白质能够清晰显现。用铅笔在重要的蛋白条带上做上标记以便以后参考。剪掉膜的多余部分。

6. 在水中再褪色 5 min 直到红色染料变淡。

7. 室温下在 200 ml 封闭缓冲液 I 中封闭 2 h，轻轻摇晃。

8. 轻轻倒掉溶液，加入 200 ml 封闭缓冲液 II。同步骤 7 —样孵育。

9. 倒掉封闭缓冲液 II，在 100 ml 1 × PBS 中轻轻漂洗。

10. 下面按厂商步骤制备用 35S-甲硫氨酸放射性标记的目的蛋白的体外翻译探针。

11. 翻译后，使用 500 W 探针纯化缓冲液稀释，室温下使用微量过滤离心柱 10000 g 离心 15~30 min 纯化探针。保存部分的纯化探针用于 SDS-PAGE 电泳分析（如 2 μl）和闪烁计数（如 2~5 μl）。

12. 用 50 ml 1 × 探针稀释缓冲液（没有探针）预孵化膜 10 min，室温下伴轻摇。

13. 用 1 × 探针稀释缓冲液稀释翻译的探针，使其体积足以没过膜（通常 3 ml）。

14. 将探针加到膜上，室温下孵育 2 h，在结合反应过程中转动试管（若在试管孵育）或摇动封口袋（若在封口袋孵育）。

15. 将膜转移到一个塑料盘中，室温下使用 200 ml 1 × PBS 洗膜 5 min。

16. 风干膜，在 X 射线胶片（放射自显影）或者磷屏曝光成像。

注意事项

1. 当使用放射性材料时，必须有适当的安全防护措施。

2. 在接触支持膜时一定要戴手套或者用夹膜钳。