G.灵芝原生质体的制备与再生

实验概要

G.灵芝原生质体的制备与再生，对G.灵芝原生质体单核化十分重要。本实验主要介绍G.灵芝原生质体的制备与再生方法。

灵芝有两种不同类型的菌丝（单倍体菌丝和二倍体菌丝）。利用原生质体再生的方法可以分离成一个单细胞，也许只含一套染色体。首先，我们把菌丝体消化成单个原生质体。然后，稀释成适当浓度的原生质体悬浮液。第三，在MYG介质中再生原生质体。

主要试剂

溶壁酶

甘露醇的PDB肉汤

MYG琼脂培养基

主要设备

摇床

培养箱

实验步骤

1. 将菌丝体接种到含100 mL的PDB介质的容积250 mL瓶中（200g土豆，20g葡萄糖，1L水）。

2. 恒温28°C避光培养菌丝体，保持培养箱以50转/分的转速持续摇动。

3. 将培养物无菌纱布过滤灭菌。

4. 取大约5g菌丝体放于容积为50 mL 的试管中，试管中含20 mL已过滤灭菌的1.5％溶壁酶和0.6 M甘露醇（广东省微生物研究所，中国）。

5. 然后30℃孵育2h，期间不时搅拌。

6. 2 h后取出菌丝片段，放于MYG琼脂培养基中（2％麦芽提取物，0.2％酵母提取物，2％葡萄糖，1.5％琼脂），用于灵芝原生质体再生。

7. 稀释原生质体悬浮至浓度为1×10 ⁴细胞/毫升，取50μL稀释后的原生质体悬浮液接种于MYG培养基中，25°C，避光培养。