H33342释放法检测单核巨噬细胞的胞毒作用

实验概要

本实验利用H33342释放法检测了单核-巨噬细胞的胞毒作用。H33342(Hoechst33342)为DNA的特异性荧光染料，可用其标记肿瘤细胞以检测单核细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。被损伤的靶细胞DNA断裂后，H33342释放到上清液中，采用微量荧光仪可定量测定上清液中的荧光强度。效应细胞的杀伤活性与靶细胞释放的荧光强度呈正相关。该方法同样可用于CTL、NK、LAK或TIL等杀伤细胞的活性检测。

主要试剂

H33342

主要设备

1. 微量荧光"W"测量板(德国Dynatech公司产品)

2. 用自动微量荧光分析仪(Micro-FluoDynatech)

实验材料

靶细胞(L929细胞株，对单核细胞的杀伤活性敏感)

实验步骤

1. 从单个核细胞中采用粘附法分离的单核细胞，经非特异性酯酶(ANAE)和台盼蓝染色，细胞纯度应>90％，细胞活力应>95％；

2. 收获靶细胞并将细胞浓度调至1×10⁷/ml；

3. 加入终浓度为10μmol/L的H33342，置37℃标记2h；

4. 用DMEM液离心洗涤3次，重悬浮于完全DMEM培养液中；

5. 将效应细胞和标记的靶细胞按一定比例(一般为20-50∶1)加入96孔圆底培养板200μl/孔，作3个复孔；置37℃5％CO₂温箱培养20h；

6. 离心后从每孔取150μl上清液，分别加至微量荧光"W"测量板；

7. 用自动微量荧光分析仪(Micro-FluoDynatech)测定3孔的OD值，求得平均值。激发波长为360nm，发射波长450nm。每次试验同时作下列对照:自发释放值:测定单独培养的靶细胞上清液荧光强度。最大释放值:测定靶细胞用1％Triton X-100裂解后的荧光强度。