ISPCR扩增的产物的杂交和检测实验

探针

SSC SDS 显影液 定影液 苏木精 PBS AEC 封阻液 NaCl Tris·Cl 二甲基甲酰胺 BCIP NBT 乙醇

培养箱 盖玻片 载玻片 干燥剂 加湿盒

1.  配如下杂交混合液

（1）2 μl 200 pmol/l 探针（终浓度4 pmol/l）

（2）50 μl 去离子的甲酰胺（终浓度50%）

（3）10 μl 20×SSC（终浓度2×）

（4）10 μl 100×Denhardt 溶液（终浓度10×）

（5）10 μl 10 mg/ml 经超声处理的鲑精DNA（终浓度1 mg/ml）

（6）1 μl 10%SDS（终浓度1%）

（7）7 μl 水

2.  加10 μl 杂交混合液于载玻片各样品孔中，样品孔中含有经原位PCR扩增的核酸。再于各孔上盖以盖玻片，放95℃加热块上加热5 min。

3.  载玻片放加湿盒中，于48℃温育2~4 h。

如用³³P-标记探针：
 

4a.  移去盖玻片，在2×SSC中洗片5 min。

5a.  将载玻片浸于稀释的Kodak乳胶中。

6a.  晾干，然后在有干燥剂的闭光玻片盒中，放3~10天。

7a.  在暗室中，按下列程序对载玻片显影：

（1）依次浸于Kodak显影液，3 min

（2）水，30 s
 

（3）Kodak Unifix 定影液，3 min

8a.  在室温下，2%Gills 苏木精染液中，温育2~3 min，对玻片进行复染。

如用通过过氧化物酶检测的生物素或地高辛标记探针：

4b.  移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸洗5 min。

5b.  加10 μl 100 μg/ml 的链亲和素-过氧化物酶溶液于载玻片各孔中，轻轻盖上盖玻片，置37℃温育1 h。

6b.  移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸冼5 min。

7b.  在暗处，加100 μl AEC工作液于载玻片各孔，37℃温育10 min，然后镜下观察，如颜色不够强，再延长显色10 min。

8b.  以自来水浸冼玻片，然后晾干。

如用通过碱性磷酸酶检测的生物素或地高辛标记探针：

4c.  移去盖玻片，室温下，在2×SSC中冼片2次，每次浸洗15 min。然后加100 μl 封阻液于样品孔中，覆盖各孔表面，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。

5c.  对每一待显色孔，用10 μl 40 μg/ml 链亲和素-磷性磷酸酶结合物与90 μl 结合物稀释缓冲液混合。

6c.  用吸水纸接触载玻片边缘、吸去封阻液，每孔中加100 μl 按上步稀释好的结合物溶液，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。

7c.  于室温下，100 mmol/l Tris·Cl pH7.5/150 mmol/l NaCl中洗片2次，每次15 min，然后，于室温下，再以碱性磷酸酶底物缓冲液，洗片1次（5 min）。

8c.  在Coplin 广口瓶中预热50 ml 碱性磷酸酶底物缓冲液至加37℃，加200 μl 75 mg/ml NBT和166 μl 的50 mg/ml BCIP充分混合。然后，将玻片放此液中置37℃温育，直至达到所期望的显色程度。（通常需10 min~2 h，可间歇性地从溶液中取出玻片，在10×物镜下观察显色程度，但勿使玻片干涸）然后，将玻片浸于去离子水中终止反应，其间换水数次。

9.  室温下，以0.2% Gills 苏木精（如用于过氧化物酶的显色）或1%核酸固红染液（如用基于碱性磷酸酶的显色）染片5 min，浸玻片于自来水中，换水数次。

10.  室温下，依次将玻片置于50%、70%、90%和100%乙醇中，分别温育1 min 进行脱水， 然后晾干。

11.  毎孔加1滴固片介质，压上盖玻片，立刻进行结果观察（小心勿动盖玻片），或放室温过夜，使压片介质干燥。
 

图一、原位反转录/聚合酶链式反应。


图二、HIV-1感染的微管内皮细胞系的DNA-ISPCR。