IgM的纯化

大多数IgM类抗体是优球蛋白不溶于水，故可用双蒸水透析纯化IgM。对那些溶于水的IgM类抗体可用饱和硫酸铵沉淀。沉淀后可以采用颗粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步纯化。

颗粒排斥层析(size-exclusion chromatography)法又称分子筛层析或凝胶过滤，是利用微孔凝胶分离不同大小分子的抗体，可用于样品中IgG和IgM的分离，常用于对硫酸铵粗提物的进一步纯化。通过该法纯化所得抗体可用于Ig分子片段的制备、FITC、生物素或同位素标记。

一、材料和试剂

1. 抗血清，杂交瘤腹水或其上清，硫酸铵沉淀粗提γ球蛋白。

2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲液，PBS。

3. 透析袋；26mm×900mm层析柱。

4. 适当筛孔的颗粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。

5. 蛋白透析、SE层析和SDS-PAGE所需的其他试剂和器材。

二、操作步骤

1. 待提取样品11，000～13，000r/min(15，000～20，000×g)，4℃或室温离心，除沉淀。

2. 上清液对双蒸水透析4℃24h。

3. 11，000～15，000r/min 4℃ 或室温离心1h，留沉淀。

4. 制备SE凝胶层析柱，以硼酸缓冲液平衡。

5. 将步骤3沉淀或饱和硫酸铵粗提γ球蛋白以3～5ml硼酸缓冲液溶解，缓慢加样。

6. 以硼酸缓冲液洗脱蛋白质，并收集100管(每管为柱床体积的1%)，IgM在洗脱液的第一个蛋白峰。

7. 收集Ig蛋白峰，分别合并，透析浓缩，紫外分光光度计OD 280nm测定Ig含量，SDS-PAGE鉴定IgM纯度。

8. 以1～20mg Ig/ml硼酸缓冲液置4℃或-70℃保存。