Isotype胞内染色有哪些学问？来看看这篇文章怎么说

　　对科研党来说，流式细胞术一点都不陌生，它以自己特有的方式从细胞蛋白水平定量检测目标蛋白的表达，并且能get到目标蛋白在各个细胞亚群中的表达，同时在细胞功能上也有很重要的作用，包括细胞凋亡，细胞周期，细胞增殖等等。

　　流式细胞术以细胞为研究对象，在流式细胞仪的作用下定量检测样品细胞的物理化学特征，其定量是以光信号为基础的，通过分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号完成定量分析。散射光信号是激光照射到细胞后散射形成的，散射光的波长与激光的波长相同；荧光信号是细胞上结合的荧光素被激光激发后产生的，一般荧光信号的波长要长于激发它的激光的波长，流式细胞仪通过光路系统将荧光信号根据波长的不同分成不同的部分，不同波长的荧光分别进入各自的接收器被流式细胞仪接收和分析。

　　在大部分流式表面染色的实验中，不需要特定缓冲液来支持，同时在表面染色中的阴性对照通常是不染色的 blank 和同型对照 isotype。所以针对表面 marker 的流式实验设计会显得比较容易。在此基础上，如果您的实验中需要用流式细胞术来探索胞内的指标，您还需要考虑其他的一些因素。

　　1选择合适的浓度

　　在细胞表面染色的实验中，抗体的合适浓度是十分重要。一样地，在胞内染色实验中依然是十分关键。抗体的推荐溶度可以在我们官网的 Technical Data Sheet 上的推荐浓度部分中找到，如下图所示：

　　BioLegend 提供的推荐浓度都是经过 3-5 点的滴定，从中选择了一个最好的信噪比的浓度作为推荐浓度。

　　虽然推荐浓度是经过我们厂内验证，但是由于您的实验环境，条件和样品的不同，您还需要进行抗体滴定来确认最适合您的实验体系的抗体浓度。如果在实验中使用的抗体不足，您可能检测不到目的群体，或者目的群体的分群不够理想。然而，倘若您在实验中使用了过量的抗体，很可能会出现所有细胞群体的背景信号增加，这样在数据分析的时候就会出现偏差，这种现象常称之为“胞内漂移”（intracellular shift）。

　　2选择合适的缓冲液

　　如果需要检测胞内指标，就需要先对细胞进行固定（fixation），然后将细胞进行透化（permeabilization）。最常见的固定剂是多聚甲醛溶液（paraformaldehyde， PFA），它能稳定细胞膜结果，之后通过去垢剂或者酒精再对细胞进行透化处理。细胞经过透化处理之后，抗体就可以直接进去入细胞内部去结合胞内的目标蛋白。目的蛋白在细胞内的定位，会决定最适合于实验的缓冲液。

　　胞浆内蛋白

　　对于胞浆内蛋白的染色，比如细胞因子，通常需要进行两步法的固定和透化处理，BioLegend 提供了两种适用的 buffer 套装可供选择：

　　a）Fixation Buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)。

　　b）新发布的 Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set。

　　如上所见，第一个选项中 fixation buffer 和 intracellular staining Permeabilization wash buffer 是独立包装的两个产品，而新发布的 Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set 是包含了 fix/perm buffer 和 perm wash buffer 的套装，并且套装是一并经过 QC 质控，相比于传统的 fixation buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)，Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set 在信噪比上的表现更好。这样的话，可以提供更稳定及可重复的结果。

　　下图为分别使用了 fixation buffer/intracellular staining Permeabilization wash buffer 和 Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set 在极化的人 Th1 细胞的胞内染色结果：

　　核内蛋白

　　如果您的研究是研究核内的指标，比如转录因子，不仅仅需要缓冲液透化外部的细胞膜，还需要透化细胞核核膜，使得抗体可以进入细胞核内，结合核内蛋白。为了做好核内蛋白的染色，我们推荐使用 True-Nuclear™ Transcription Buffer Set 来作为实验缓冲液。这是我们 FOXP3 Fix/Perm Buffer Set 的升级版。某些核膜透化的buffer会影响串联染料的表现，增加溢漏到串联染料的 donor 通道的荧光补偿。

　　人全血使用APC/Cy7 CD3抗体（蓝色和红色柱状图）或APC/Fire™ 750（绿色和紫色的柱状图）染色，然后进行红细胞裂解，清洗之后再按以下条件进行固定：A、使用FOXP3 Fix/Perm Buffer固定后用FOXP3 Perm Buffer进行透化（紫色和红色）；B、使用True-Nuclear™ Fix Buffer固定，再用True-Nuclear™ Perm Buffer透化（绿色和蓝色）。

　　从上图中可以看到，使用 FOXP3 buffer 套装时，APC/Fire™ 及 APC/Cy7 溢漏到 APC 通道的补偿值明显大于 True-Nuclear™ Transcription Buffer Set.

　　磷酸化蛋白

　　当我们使用磷酸化特异性的抗体分析细胞内的蛋白磷酸化水平时，就需要能够比胞浆内染色及核内染色更强力的固定破膜剂。在做磷酸化蛋白的染色时，推荐使用基于甲醇的，专门为磷酸化蛋白染色优化的 True-Phos™ Perm Buffer。

　　上图中是人全血使用（右图）或不使用（左图）IL-6刺激15分钟之后，使用RBC/Lysis Fixation Solution 进行裂红处理，然后使用True-Phos™ Perm Buffer进行透化，之后使用CD3 APC和 STAT3 pY705（clone 13A3-1）FITC进行染色。

　　由于 True-Phos™ Perm Buffer 含有甲醇，在使用时需要注意用于表面染色的抗体是否适用于含有甲醇的缓冲液。甲醇有时会改变甚至破坏抗体识别的表位。所以，在正式实验之前，需要通过预实验或者文献来确定表面染色所用的抗体是否适用于甲醇固定的样品，BioLegend 的网页 fixation page 中，提供了我们厂内测试的一些克隆号在 4% PFA 固定之后的表现，虽然它们不是甲醇固定，但是依然是您参考的一个方向。如果您选用的抗体克隆不适用于甲醇，那可以尝试在固定之前对表面指标进行标记，不过需要注意的是选用甲醇不敏感的荧光素，如下表所示：

　　“特殊照顾对象”

　　凡事皆有例外，尽管我们提供了多种 buffer 来匹配相应的实验，但是不得不承认，依然有某些克隆的抗体，我们还未优化好相应的 buffer，比如 Ki-67 的 16A8 克隆号的抗体。不过，16A8 可以使用 70% 冰乙醇作为固定破膜剂，详细的使用请见相应的产品说明书。

　　3选择合适的对照

　　何为阴性何为阳性？选择合适的对照就显得格外重要。我们的官网中介绍了流式实验中的常见对照组：https://www.biolegend.com/flow_controls

　　同型对照-isotype control

　　假如您的实验只涉及了细胞表面的染色，同型对照就是一个理想的对照组。但是在胞内染色时，只有同型对照，还不足以准确地进行数据分析。在做胞内染色的流式实验时，我们时常发现整个细胞群体都发生了漂移，这样就会在数据分析的时候误导我们，难以判断什么才是真正的阳性细胞群体。所以在胞内染色实验时，isotype 只能作为一个参考，但是不能作为最终划门的标准，尤其在那类阴阳性细胞有明显的界限的情况下。如下图所示，假如您是按照 isotype 的 MFI 值来划定十字门（黑色实线），您会在 Q1 和 Q2 门里发现，阳性细胞的比例变高了。如果按照阴性和阳性的分界线来划门（红色实线），您获得的数据就会更加准确。

　　生物学对照

　　当做胞内细胞因子或者信号通路分子的胞内染色时，选用生物学对照作为划门的标准是个不错的选择。比如说，您的样品细胞是 PMA/Inomycin、LPS 或者 CD3/CD28 刺激的细胞，您也应该同时准备相同类型的细胞，但是不给予相应的刺激。这样才能区分出刺激前后，目的蛋白的本底表达水平和接受刺激之后细胞应答所产生的表达变化。

　　人外周血极化得到的Th2细胞仅使用monensin处理（上左图）或使用monensin及PMA、Ionomycin处理三小时后（上右图）使用CD3（x轴）表面染色和GM-CSF（Y轴）胞内染色结果。

　　荧光减一对照（FMO）

　　除了以上的对照组外，还有一个重要的对照，即荧光减一对照。顾名思义，FMO 指的是使用的荧光为您样品所有染色指标减少一个指标的对照。这一对照不仅可以帮助您界定弱表达指标的阴阳性，还可以在多指标的 panel 中帮您从荧光溢漏的信号中区分出阴性群和阳性群。

　　希望通过本文，可以帮助您理解胞内染色实验中的一些注意事项，比如确定合适的抗体浓度、buffer 以及合适的对照。最后，愿各位研究者能够获取一致并且可信的数据。