LCMS／MS对兽药多残留检测的提取和净化

应用优势

•高效、省时的多级/多残留方法。

• 直接制备大量组分样本。

•快速、灵敏UPLC®/MS分析

沃特世解决方案

ACQUITY UPLC®, Xevo® TQ MS, Sep-Pak® C18柱

关键词

UPLC-MS/MS、Sep-Pak固相萃取柱、兽药、猪肉、鸡肉、鱼

概述

为了确保公共健康安全，需要对肉类和其他可食用组织样本中兽药残留含量进行可靠地筛选分析，相应化合物包括强极性水溶性化合物至非极性脂溶性化合物，每种化合物或每类化合物都有非常有效的提取和净化程序，但这些方法并不非常适合于多级、多残留物的筛查分析。

• 溶剂提取(用过量乙腈或甲醇)对于牛奶中的许多兽药残留物可很有效，但该方法并不太适用于如沙丁胺醇等高水溶性的药物。

•缓冲溶液提取也能适用于许多化合物，但如地塞米松等脂溶性化合物并不太适用于该方法。

•传统固相萃取(SPE)浓缩和净化(富集/淋洗/洗脱)在多残留物分析中的应用有限，因为不同化合物的酸性/极性/溶解度范围非常宽，分散型或透过型SPE更适用于多残留物方法。

引言

为串联LC/MS检测组织样本中的大量不同兽药残留物开发了优化样品制备和分析方案。选择了三种类型的肌肉组织样本(猪肉、鸡肉和鲑鱼肉)介绍该方法的适应性，用酸化乙腈/水溶剂处理样品和沉淀蛋白质，提取兽药成分。然后使用Sep-Pak C18固相萃取柱或96孔萃取板进行简单SPE净化，经过蒸发和复溶后，使用串联LC/MS分析样品，从主要兽药中选择有代表性的化合物，包括四环素、氟喹诺酮、磺胺类药物、大环内酯类、β-内酰胺、非甾体类抗炎药、类固醇和β-肾上腺素。

实验

LC条件

系统： ACQUITY UPLC 系统

色谱柱： ACQUITY UPLC CSH™ C18, 1.7μm,

100 mm x 2.1 mm内径

流动相： A：0.1%甲酸的水溶液

B：0.1%甲酸乙腈溶液

进样量： 7 微升

进样模式： Partial loop 进样

柱温： 30 °C

弱洗脱溶剂： 10:90乙腈:水(600μL)

强洗脱溶剂： 50:30:40

水：乙腈：IPA(200μL)

密封清洗： 10/90 乙腈/水

梯度:

质谱条件

检测器 Waters Xevo TQ

电离模式： 正离子电喷雾电离

(除氯霉素使用负离子模式外)

离子源温度： 150°C

脱溶剂气温度： 500°C

脱溶剂气体流速： 1,000 L/hr

锥孔气体流速： 30 L/hr

碰撞气体流速： 0.15 mL/min

软件： MassLynx® v4.1

样品制备

1. 分离/沉淀

将5克均化组织样本置于50毫升离心管中，加入10毫升含有0.2%甲酸的80：20乙腈/水溶液中，涡旋震荡30秒钟，在振荡器放置30分钟，用12000rpm离心5分钟。萃取/沉淀过程会很好地提取多数化合物组分，但也会提取大量脂肪。

2. SPE净化

量取1毫升上清夜(从步骤1)，用Sep-Pak C18固相萃取柱或萃取板进行SPE净化(见图1的SPE详细内容)该步骤会清除脂肪和非极性干扰物。

Sep-Pak C18固相萃取柱1cc、100毫克

图1. SPE净化方案。

表1总结了该实验中的MRM离子对和仪器参数。表1中还有每种化合物的典型基质匹配校准数据(使用猪肉基质中的离子对计算)。

表1. 鸡肉基质中得到的MRM离子对和校准数据（其他基质类似）。

结果

图2显示了10ng/g的红霉素基质标得到的典型LC/MS色谱图，其他化合物性质类似。表2显示了组织样品加标回收得到的回收率数据表3显示了观察到的基质对多残留物分析的影响。

图2. 用10ng/g红霉素加标的猪肉得到的LC-MS/MS提取离子色谱图。

讨论

该研究中使用的方法是Lehotay等人1和Martos等人2提出的方法开发，参考文献1中使用的方法在组织提取溶剂中未使用酸，在这样的条件下我们发现四环素的回收率低于5%，氟喹诺酮的回收率高于50%，参考文献2中使用的方法介绍在离心处理前将萃取物用1%甲酸酸化处理，这样的条件下青霉素的回收率低于10%，而我们的方法则为48%，我们的萃取程序综合参考文献1和参考文献2所介绍方法，采用了类似的乙腈/水萃取方法，但甲酸浓度为0.2%，实现了更均衡的回收率和最低的不稳定化合物的降解。

另一种方法基于Kauffman等人3提出的方法，其中进行了两次萃取，第一次是用琥珀酸缓冲液萃取水溶性化合物，第二次用乙腈在萃取过的固体颗粒上再进行一次萃取，该方法要求对样品进行单独的提取，然后将提取溶剂混合进行分析，性能仅比之前的方法稍好，但时间和材料成本却明显降低，该研究选择的萃取、净化和分析方案实现了前处理时间、成本和方法性能之间的良好平衡。

表2. 从三种基质的加标组织样品中的回收率数据。

表3. 观察到的三种基质的加标组织样品的(%离子-抑制)基质影响(负
值为离子增强)。

结论

• 为肉类、鸡肉和鲑鱼分析开发和演示了一种简单的萃取/蛋白质沉淀方法。

•该方法适用于筛查大量不同种类的兽药残留物。

• 回收率平均为60%，所有组织都类似。

• 使用Sep-Pak C18的穿透式SPE净化方案可以有效清除残留脂肪。

•样品前处理方法可得到无颗粒的萃取物，在LC/MS分析前无需再进行过滤。