LacZ和trpE融合蛋白的表达及纯化实验

大肠杆菌

氨苄青霉素 IAA IPTG PBS 盐酸胍 Tris·Cl

超声波发生器 透析袋 转子 离心机

利用pUR载体表达lacZ融合蛋白：

1a.  按正确的读框将目的基因亚克隆入pUR载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，在LB/氨苄青霉素平皿上挑选转化子。

2a.  接种含表达载体的单菌落于2~5 ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃振荡培养过夜。

3a.  取1 ml 过夜培养物加入盛于2 L 瓶中的400 ml LB/氨苄青霉素培养基中，37℃振荡培养直至OD₆₀₀达到0.5。

4a.  加1.6 ml 100 mmol/l IPTG（终浓度为0.4 mmol/l），继续培养2 h。

利用pATH载体表这trpE融合蛋白：

1b.  按正确的读框将目的基因亚克隆入pATH载体中，转比大肠杆菌感受态细胞，在添加了色氨酸的M9培养基平皿上挑选转化子。

2b.  接种含表达栽体的单菌落2~5 ml 添加了色氨酸的M9培养基中，按步骤“2a”般培养过夜。

3b.  取1 ml 过夜培养物加入400 ml 不含色氨酸的M9培养基中，37℃下剧烈振荡培养至OD₆₀₀=0.5。
 

4b.  加入1.6 ml 的2.5 mg/ml IAA（终浓度10 μg/ml），继续培养2 h。

5.  将细菌培养物倒入两个200 ml 离心瓶中，4 000 g 离心10 min。

6.  在沉淀中加入5 ml PBS，上下吹打使之重悬，将每瓶的沉淀移入一个15 ml 锥形离心管中，3 000 g 离心10 min。

7.  将细菌重悬于2 ml 含蛋白酶押制剂的HEMGN缓冲液中，加20 μl 50 mg/ml 溶菌酶，在冰浴上放置5~30 min。

8.  用微探头超声波发生器破碎细胞，每次15 s，共2次，在超声处理的间隔期，样本应置于冰浴。将裂解物倒入一个50 ml 离心管中。

9.  将细胞裂解物以27 000 g 离心15 min，倒出上清并予保留。保留沉淀，其中含有几乎全部的不溶性的诱导蛋白。可溶性蛋白的制备按下一歩骤进行。

10.  将沉淀重悬于2 ml 含蛋白酶抑制剂的HEMGN缓冲液中。

11.  加入2 ml HEMGN缓冲液/8 mol/l 盐酸胍（胍的终浓度为4 mol/l）4℃下温和地振荡30 min。

12.  在预先冷却的超速离心机内以27 000 g 离心30 min，或4℃下27 000 g 离心20 min。

13.  将上清移入透析袋中分2步透析，每次3 h 以上甚至过夜：首先在500 ml HEMGN缓沖液/1 mol/l 盐酸胍中透析，接着在1 L 不含胍的HEMGN缓冲液中透析。

14.  将所有材料移入离心管中12 000 g 离心5 min，保留上清，它是一种清亮、无色的液体，蛋白浓度约为1 mg/ml。（融合蛋白一般占总蛋白的1%到10%），不溶性沉淀通常也含有融合蛋白，可用于凝胶纯化，应予以保留。

15.  用Bradford 法测定细胞裂解物上清及沉淀及胍提取后最终的上清及沉淀中的蛋白质浓度。经SDS-PAGE检验诱导结果，每孔加样5~ 10 μg的蛋白质。