Lowry检测法测定蛋白质浓度实验

Lowry 法又称为 Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂 （Folin-酚上级），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色 的复合物在745～750 nm 处有最大的吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

待测蛋白质样品

五水硫酸铜柠檬酸碳酸钠NaOHFolin-酚试剂

分光光度计比色杯移液管枪头和加样枪试管（3～5 ml）试管架震荡器

1. 溶液

1.1 溶液 A，100 ml

0.5 g CUSO₄·5H₂O

1 g Na₃C₆H₅O₇（·2H₂O）

加双蒸水至 100 ml， 溶液可长期保存于室温。

1.2 溶液 B，1L

20 g Na₂CO₃

4 g NaOH

加双蒸水至 1 L， 溶液可长期保存于室温。

1.3 溶液 C，51 ml

Folin 溶液A

50 ml 溶液B

1.4 溶液 D，20 ml

10 ml Folin-酚试剂

10 ml 双蒸水

2. 检测

2.1 用双蒸水稀释样品至 0.5 ml；

2.2 加 2.5 ml 溶液 C；

2.3 混匀在室温下放置 5～10 min；

2.4 加 0.25 ml 溶液 D， 混匀；

2.5 20～30 min 后，在分光光度计上测 A₇₅₀ 值。

3. 从干扰物质中纯化蛋白质样品的附加步骤

脱氧胆酸-三氯醋酸（DOC-TCA）沉淀法。此法可在测定蛋白质的溶液浓度低于 1 ug/ml 情况下使用。

所需试剂：0.15 ％ （w/V）DOC：72 ％ TCA

3.1 于 1 ml 蛋白质样品中加入 0.1ml 0.15 ％ DOC；

3.2 震荡后在室温放置 10 min；

3.3 加入 0.1 ml 72 ％ TCA， 摇匀后，1000～3000×g 离心 5～30 min。如使用固定角转头，以及低温或大体积则需较长时间离心；

3.4 倾斜，吸弃上清液；

3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。

1. 在加入试剂 20～30 min 后呈色达到饱和，此后每小时颜色信号减弱 1 ％。

2. 许多干扰物质降低颜色反应，而去垢剂引起颜色轻微升高。

3. 高浓度盐可引起沉淀。

4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂质，在 K^＋ 或 Triton X-100 存在时可通过离心去除混浊物。