MD酶标仪应用：细胞活力和毒性分析的原理和方法（一）

一、简介

靶向细胞的科研研究和药物研发避免不了细胞活力的分析和追踪。但依据实验的最终目的和关注参数的不同，细胞活力的体现，检测方法也会不一样。例如细胞增殖检测适用于比较不同细胞株增殖能力，而细胞毒性分析则可以用于探究候选药物是否有细胞毒性等。从分析仪器上来说，现阶段主流的检测平台，如显微镜，流式细胞仪和实时荧光定量pcr仪等都可用于细胞活力的分析，但不同的平台所关注的指标，灵敏度和通量会有所差异，因此需要依据所回答的生物学问题和指标选择合适的检测平台。在上述平台中，酶标仪提供了96、384孔板的高通量细胞活力检测方法，灵敏度上能和经典的[3H]胸腺嘧啶掺入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美，因此成为了主流的科研和工业研发中细胞活力和毒性分析平台。相应的，细胞活力分析也成为了酶标仪的基础应用之一，也是Molecular Devices (MD)关注的主要应用。

在本手册中，我们会从酶标仪出发向大家介绍，对比主流的细胞活力，毒性分析方法，并通过详细的应用材料向大家展示如何应用MD酶标仪和软件轻松，专业的完成细胞活力，毒性分析。

二、细胞活力分析

此部分主要关注常见的细胞活力分析方法，如MTT和ATP法等。虽然这些检测方法也常用于分析药物毒性和安全性，但相较于乳酸脱氢酶细胞毒性检测等方法，它们更关注细胞活力的变化。依据原理的不同，细胞活力检测方法主要分代谢法，酶活法和ATP法。

2.1 代谢法

2.1.1原理和介绍

代谢法是最常见的细胞增殖检测方法，其主要包括四氮唑还原法(Tetrazolium reduction)，如MTT和CCK-8法等，和刃天青还原法(Resazurin Reduction)，如alamarBlue法等。这些方法的原理都是基于细胞的代谢能力还原孵育的底物，其产物通常具有光吸收或荧光属性，因此能用酶标仪进行高通量细胞活力分析。

上述方法中，最常见的是MTT法，其属于酶标仪光吸收应用，利用细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶对MTT的还原，形成不溶于水的结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中和细胞外。最后使用特定的有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)等溶解后进行 570 nm处检测[图一]。由于MTT本身具有正电荷，因此容易进入细胞，并具有一定的代谢毒性。同时，确切上说，MTT法是检测细胞线粒体的代谢活力。

图一，MTT法原理，图片来源于https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

近年来在MTT的基础上一系列类似结构的底物被应用于细胞增殖活力检测中，主要包括MTS, XTT, 和WST等，它们同样属于酶标仪光吸收应用。与MTT不同，这些底物本身具有负电荷，因此不易进入细胞，同时其还原产物可溶于水，因此无需溶解结晶步骤，提升了实验的操作性和稳定性。该系列中，最常见的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相较于仅依赖线粒体脱氢酶的MTT法，CCK-8法基于细胞内多数的脱氢酶，因此其检测活力更为准确，灵敏度更高，同时降低了细胞毒性[图二]。由于省去了溶解步骤，CCK-8法支持动力学检测，提高了实验的灵活性。同时因其毒性低，细胞在完成CCK-8法检测后还可以用于后续的其他检测。