MSCs培养物的扩增和冻存实验

MSCs                                                          

无菌完全培养培养基（CCM）、PBSA、胰蛋白酶 EDTA                                                          

聚丙烯离心管                                                                  15 mL和50 mL、塑料组织培养皿                                                                  直径15 cm、塑料微量移液器枪头                                                          

(a)检査所得的MSCs。如果培养物中小的、贴壁、纺锤形的成纤维细胞样细胞汇合至60%时，对其进行处理。如果单层细胞稀疏,继续润洗和更换培养基。

(b)按如下步骤消化单层细胞：用20 mL预热的PBSA润洗单层细胞后，加人5mL胰蛋白酶/EDTA。将培养皿置于37℃ 2min，在1O×放大倍数视野下观察单层细胞。贴壁细胞应正从塑料培养瓶上脱落。将培养皿置于37℃ 2min,再次观察。重复观察直到90%的MSCs已从培养瓶中脱落下来。加人5mL CCM,将10mL悬液移至15 mL离心管中，500g离心10 min。离心完毕，弃去上清，每管用1〜2mL预热的PBSA重悬沉淀。如有必要，混合多管细胞悬液只进行一次细胞计数。

(C)取10μL细胞悬液加人到10μL台盼蓝中，用血细胞计数器进行计数。合适的细胞悬液浓度为（2〜5)×10⁵个细胞/mL，存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于传代的早期培养物悬液，亦可进行集落形成单位（CFU)测定、冻存或分化测定。

(d)将细胞以50〜100个细胞/cm的密度接种到培养皿中，保持低密度以保证快速的自我更新和多潜能特性。用预热CCM以7×10³(最终密度为50个细胞/cm2)到1×10⁴(最终密度为100个细胞/cm²)的密度重悬MSCs。

(e)预备适当数量的15 cm培养皿，加人25 mL预热的CCM。

(f）接种1 mL步骤（b)和（c)所得的细胞悬液。来回滑动平皿（勿打圈）使细胞分布均匀。培养皿置于培养箱中，标记为一代细胞。

(g)培养2〜3天后，观察并评价形态。MSCs应为小的、纺锤体形状，频繁折光的双联体。此为培养良好的MSCs。

(h)从培养皿中吸出培养基，用20 mL预热的PBSA润洗，加入25 mL预热的新鲜CCM。

(i)每次传代时所需的培养皿数量取决于可以接种的细胞数量。方案中的上述体积适用于MSCs接种至单个15 cm培养皿。如有需要可按此例扩大以接种多个培养皿。