MTT法细胞活性检测实验步骤

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT主要有两个用途：（1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；（2）细胞增殖及细胞活性测定。

MTT方法能简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应，并且其价格低廉，成为日前各实验室检测细胞活性的首选方法之一。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值）来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

一、MTT 溶液的配制

1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg，250mg或1g。对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20℃。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

2、注意事项：

（1）在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（2）配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

（3）MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用时需小心。

二、MTT甲瓒溶解液

1、二甲基亚砜DMSO：可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

2、三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用双蒸水溶解配成100ml溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

三、MTT法实验步骤

1、胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

2、将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3、将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药（两小时——半天时间），但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔，建议设6个，否则难以反应真实情况。 

注意：对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。 

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 

6、终止培养，准备溶解结晶。

溶解结晶的方法有两种，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。 

2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液：

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）

2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

四、MTT结果分析

关于如何计算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 最大剂量

I：lg(最大剂量/相临剂量)

P0：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。