MassARRAY核酸质谱实验操作方法与技巧

     实验总是从样品开始，完善的样品质控和挑选是整体测试成功的关键。MassARRAY平台适合多种来源样本的检测，比如血液，口腔拭子，显微切割和新鲜冰冻组织、毛囊等等，总共仅需10ng DNA即可完成数十个位点的检测。提取的DNA可在4℃保存24小时，如需要放置超过24小时，则需将DNA样品保存于-20℃条件下，A260/A280应在1.7-2.0之间。

      对于不同分子量的片段，质谱仪的检测效率不同，为了使各个位点的检测效率达到较一致的水平，需要将体系中的延伸引物UEP调整到适当的浓度。具体方法如下：

将2µL UEP mix用超纯水稀释到50µL，按照通用流程进行质谱检测，比较每一条UEP的峰高。根据每一条UEP的加样量和峰高，按照正比计算，补加或者调整对应的UEP。通过浓度调整，达到最低峰高度为最高峰高度的一半即可。考虑到国内引物合成的批间差，建议每次新引物订购后都进行延伸引物UEP 的检查。

调整前

调整后

     转化率可以用来判断延伸引物的转化效率以及样本是否因缺少转化产物而导致检测失败。

转化率较差

转化率较好

     如果在新panel验证实验中发现某些位点有转化率较低的问题，可以通过调整PCR引物、更改延伸引物等方法来优化和改进。一旦panel优化完毕，该设计就可以确定下来并一直使用下去。

      NTC即No Template Control，也即用水来代替模板进行实验。可用来检测体系中是否有非特异延伸以及环境中是否存在气溶胶污染，采用新的检测panel时，建议实验过程中每一组assay都加入一个NTC，这样可以方便地确认该panel的表现度是否符合预期，以及在哪些方面需要优化和改进。

     Calibrant是含有不同大小oligo的标准品，可以作为阳性对照判断仪器是否正常运行，激光是否需要调整。每张芯片都有专门用于Calibrant的matrix pad，按照说明书取一定量的Calibrant放入对应位置，在点样和质谱分析时勾选对应选项即可。

      Agena的技术人员在提供技术支持的时候，一般都需要查看NTC以及Calibrant的情况。

     通过计算机完成了Panel设计后，总是要通过真实的验证实验来确定原先的设计是否可靠，以及是否需要针对某些位点做改进和优化。一般来说，大部分的位点都会表现良好，但是如果有某些位点与预期有偏差，也有相应的解决方案，比如：

i）PCR引物加倍：适用于位点转化率低的情况

ii）重新设计PCR引物：适用于位点扩增失败或者转化率低的情况

iii）反向UEP设计：适用于正向UEP有不可避免的dimer或者hairpin等影响延伸或者延伸失败的情况