1.将38克培养基（或上面列出的组分）悬浮在1升纯净水中。
2.彻底混合。
3.经常搅拌加热并煮沸1分钟以完全溶解组分。
4.在121℃下高压灭菌15分钟。
5.冷却至45°C
6.将冷却的Mueller Hinton Agar倒入水平的水平表面上的无菌培养皿中，以获得均匀的深度。
（注意：必须将板倾倒至4毫米的深度（对于100毫米板，大约25毫升液体琼脂，对于150毫米板，大约60毫升液体琼脂，但在任何情况下，测量深度为4毫米）。太浅的平板会产生错误的敏感结果，因为抗微生物化合物将比它应该进一步扩散，产生更大的抑制区。相反，浇注到> 4 mm深度的板将导致抗假结果。）
7.在室温下固化。
8.检查制备的Mueller Hinton琼脂，确保最终pH值在25°C时为7.3±1。
（注意：如果pH值<7.2，某些药物似乎会失去效力（氨基糖苷类，喹诺酮类，大环内酯类），而其他药物似乎有过量活性（四环素）。如果pH> 7.4，则可能发生相反的结果。）
9.准备好的介质可以在4到8°C的温度下储存。Mueller-Hinton琼脂从制备之日起约70天稳定。
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