NGS体细胞突变检测两三事

二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）是一个强大的功能平台，它可以同时给数以万计的DNA分子进行测序。由于这种可以多个样本同时测序的能力，在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序也就是高通量测序开创了革命性的领域。但是，对于癌症分子诊断、治疗和监测等需要检测低频基因变异的领域，二代测序错误是一种可能影响变异检测结果的关键混杂因素。

我们常用的体细胞突变（somatic mutation）检测软件包括：mutect2、strelka、varscan等。那么对于突变检测，我们还有哪些要注意呢？

一个典型的NGS工作流程包含多个步骤，包括样品处理、DNA提取、PCR扩增、上机测序。这些步骤中的每一步都可能引入错误。例如，样品处理过程中的DNA损伤可引起C>A/G>T错误，DNA提取或片段化过程中甲基化胞嘧啶自发脱氨成尿嘧啶可引起C>T/G>T错误，另外，目标富集PCR及测序步骤也会引入一些错误。

在体细胞突变检测中，你是否会注意一些异常现象，偶尔会发现一些突变被质控掉了，但这是个例吗？回顾数据会发现，咦？好像同批次个别样本也会有这个突变？例如序列CAGCCGCATCCACCGGTAGCTCTTCTTCTTCTTGCGCT，红色是deletion区域。当然，这个突变被质控掉了，变异检测软件标记的str_contraction。但你是否有看数据的习惯呢？仔细观察突变附近的基因组序列发现该缺失有四个重复单元，是短串联重复区域(STR区域)的特征，这与注释也相符。我们知道，STR检测一般会有滑脱现象，等位基因数值越大（重复的单元数越多）滑脱越多，而等位基因数小的理论上滑脱的可能性很低。

表1 异常体细胞突变示例

并且对于不同的基因组版本都存在这个现象。另外，由于该突变在同一批数据的多个样本中发现，突变频率较低。到底是捕获探针（原材料）的问题呢？还是STR区域的问题？还是NGS手段的问题？重新设计多重PCR引物，对样本进行检测发现与捕获探针一致，对NGS各个平台、公司的数据回溯分析，包括肿瘤样本和正常样本，发现超过20%的数据（正常对照）包含这个位点，而且频率都比较低（1%上下浮动）。

表2 不同公司不同产品不同测序平台分析

因此判定这个位点是NGS系统性的误差。那就要考虑基因STR区域本身的特点造成的，STR到底是个什么东东呢，为什么会有这种诡异的影响？让我们来解开它神秘的面纱。短串联重复序列(Short tandem repeats, STR)，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，通常是基因组中由1~6个碱基单元组成的一段DNA重复序列，是广泛存在于真核生物基因组中的核苷酸重复序列。由于重复单位及重复次数不同，构成了STR基因座的遗传多态性。每个STR由结构包括：具有短重复单元的核心区、核心区两侧保守的侧翼区。

图1 STR结构示意图

图2 微卫星的滑链错配突变模型