NGS测序中，接头是如何添加上的，以及如何去接头

我见过的相当一部分人，做质控时，一般也就就是跑个实验室或者公司的祖传代码，但对于软件所做的操作不求甚解，归根结底，是因为对测序流程中，接头是怎么加上去的不太了解。

现在我们接触的大多数二代测序数据，都是来自于illumina测序平台。这其中，大多数illumina文库的构建，是通过将接头连接到fragment DNA/cDNA的两端（但是Nextera方法除外，因为技术相对不常见，这里不深入展开）。 下图是一张很经典的加接头的示意图，图片下载于网页 http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq

正如图所示，大概分为如下步骤。

• 用酶或者激光或者超声波将Genomic DNA或者由RNA反转组得到的双链cDNAs打断成小片段

• 打断是随机打断，有可能末端不平整，还需要用酶补平

• 补平之后，需要在3’端加A碱基

• 加上A之后，再加adapter

这时候，我们好像心里有那么点数，但是依然不知道adapter具体是怎么加上去的，也并不知道接头中，read1 sequncing primer, index, read2 sequencing primer,以及index sequencing primer到底在接头的什么地方。

那，是时候放出这张图了。

看完这张图，我们感觉对接头的添加这个过程的理解，好像多了几分。如果我们看上面这两张图，感觉就是在fragment DNA两端直接加了一个Y字形的引物，它被称人称为Full Y-adapter或者forked adapters。

但我们如果看illumina的官方视频，能够看到如下几帧介绍。

（上面的图是我从视频里截取下来，文字是根据我听到的加上去的）

从图片中我们能够看到，在“接头”添加之前，接头上好像已经有另一个叉形接头了，那这是咋回事呢？ Y形接头不是直接添加到DNA fragment上的吗？

其实这是两种不同的indexing strategy导致的差异， 而这两种strategy的示意图，如下图所示。

左边的是直接在fragment DNA的两端直接加上full Y-adapter, adapter中已经包括了和P5/P7 oligo互补的序列, index, 以及Read1/Read2的测序引物。

右边的那种是先在fragment DNA的两端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互补配对的序列以及index序列。

一句话总结，这两种不同的indexing strategy的差别在于引入index序列的时机和方式不一样。

其实右边的图并不是画的特别形象，具体的的可以参看下面这张图，图片的来源是https://www.fimm.fi/en/services/technology-centre/sequencing/next-generation-sequencing/dna-library-preparation

在这里我们能够清楚地看到，这种接头添加过程中，fragment DNA两端是先连上PE adapter, 然后再通过PCR引入的region complementary to P5/P7 sequence, index, and sequencing biding sites.

如果你的序列含有TruSeq Universal Adapter, 这时候可以采用如下去接头的代码。至于如何判断你的序列里到底有没有TruSeq Universal Adapter，可以下次单独写一篇来讲解。

去接头代码：

cutadapt --times 1 -e 0.1 -O 3  -m 30 -q 25,25 -u 8 -a AGATCGGAAGAGC -A AGATCGGAAGAGC  -o trimmed.1.fastq.gz -p trimmed.2.fastq.gz  reads.1.fastq.gz reads.2.fastq.gz

我们今天的收获是：

• illumina文库构建的一般方式

• illumina接头的两种添加方式（两种不同的indexing strategies）

• 如何用cutadapt去除TruSeq Universal Adapter

只是一个很小的细节，我们就讨论了这么多，今天就讨论到这里，下次我们再接着结合illumina官网的序列，用实实在在的碱基序列示意图来讲解，为什么要这么来去接头。

附上illumina官网的测序原理介绍视频如下：