NK细胞培养存在的问题与解决方法

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

目前，NK细胞培养存在两种培养方式：

1、滋养层细胞（人肿瘤细胞，即人白血病K562细胞）培养方式。

首先获得具有不分裂不增殖但仍保持代谢活性的滋养层细胞。该细胞通过基因工程技术进行改造，再经过钴60辐照，细胞膜表面稳定表达多种细胞因子，在多种细胞因子协同作用下，外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞得到定向激活和扩增。

该种培养方式的价格相对便宜，仅有3000元左右。从培养结果来看，细胞收获量可达到20亿/L的水平，NK表型阳性率达到80%-90%左右。

2、纯因子细胞培养方式。

顾名思义就是使用相应的细胞因子来刺激单个核细胞，向NK细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，使NK细胞大量增殖。纯因子细胞培养技术以其安全性高而著称，其原因在于所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的。培养过程相当于模拟体内环境，促进NK细胞的激活及大量增殖。

从培养结果来看，细胞收获量可达到15-25亿/L的水平，NK表型CD3-CD56+达到40%-90%左右。日本在该项技术上走在国际前列。由于日本老龄化严重，因此抗衰老研究较多。NK细胞在抗衰老研究中的应用符合其严格的风险管理原则。因此国内使用的纯因子试剂盒多进口自日本。但由于技术壁垒，纯因子试剂盒的价格一直居高不下，多在6000元以上。

但从培养结果来看，滋养层细胞培养方式性价比更高，但由于在培养过程中选用的滋养层细胞为肿瘤细胞，用户对此种培养方式实际是心存排斥的。尽管从理论上讲，经过相应处理的肿瘤细胞已经不再具备增殖的可能性，但其潜在风险难以证明可以完全排除。另外，就是伦理方面的问题，将正常细胞与肿瘤细胞共培养，然后将培养后的NK细胞回输体内，确实存在难以克服的伦理障碍。正如上述原因，确实制约了滋养层培养技术的推广。

2016年，某国产品牌在生物谷细胞治疗会议中推出国内首款NK纯因子培养产品，两年间，300多家用户对该产品的评价差异极大：大部分觉得很好，可以得到满意的结果；一部分觉得不太好，因为不是所有样本的培养结果都让人满意，总是有某些样本的细胞数量少或者NK表型低。

经与用户深入沟通，友康生物发现结果不理想的主要原因是某些样本在培养的前半程（7天之前）密度上升缓慢，用户难以贯彻厂家的补液原则。培养液不是补多了就是补得少，那结果会怎样呢？

1、培养液补得多。培养液补多了，则NK细胞的密度更低，细胞生长更加缓慢，导致在2天后新的补液时点到来时，密度更加达不到补液要求。

2、培养液补得少。补液补少了，NK细胞生长过程中的代谢产物无法充分稀释，整个培养环境变得有毒害，导致NK细胞密度更加难以上升。这类样本，有的用户2L培养体系仅能收到10亿-20亿的细胞数量。仅为正常值的15%-30%，给用户造成了极大的困扰。

这种现象，在厂家看来是有些客户尚未能完全掌握NK细胞的培养技巧导致。但站在用户的角度来说，如果厂家在产品设计环节能够做到不需要用户面对NK细胞前期生长缓慢的情况，是不是就可以大幅减少甚至完全避免用户的操作错误呢？是不是就可以大幅提升用户自己的培养结果吗？

结果是肯定的。于是友康生物根据客户的反馈，重新设计了NK前期培养中的激活、扩增等环节的技术处理，推出2018版NK纯因子培养产品。即便是状态比较差的样本，也可以在培养前期（7天之前）达到一个较高的生长密度，跳过了需要极其丰富经验才可正确应对的在细胞密度过低时的补液要求。

此次产品升级的不是该产品的理论性能，即厂家的技术人员或经验丰富的客户技术人员可以达到的培养结果；而是该产品的实际性能——客户的经验不太丰富的技术人员可以达到的培养结果。客户的技术人员仅仅需要按照厂家给出的补液原则常规补液即可，不会再遇到前7天细胞生长密度达不到理论密度的情况。极大降低了NK培养难度，大幅提升了该产品在客户处的培养结果：50ml外周血或50ml脐带血，均可达到40-60亿/2L的细胞总数，60-90%的CD3-CD56+阳性率的培养结果。

外周血NK细胞倍增曲线：

细胞总数44.2亿/2L 体系；CD3-CD56+：72.0%

脐带血NK细胞倍增曲线：

细胞总数40.8亿/2L 体系；CD3-CD56+：63.1%


另外，针对客户提出的培养瓶与培养袋的组合困惑问题，友康生物在机理方面进一步明晰了NK细胞培养全程中培养瓶与培养袋之间接力培养的工艺细节与陷阱，给出了明确无误、结果可信的操作指导，将指导用户避开培养失败陷阱，可大幅提供用户的培养成功率，为用户的业务拓展奠定坚实的产品基础。