Nacia数字PCR在基因表达分析中的应用

华盛顿大学医学院儿科和加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院儿科的研究人员建立了一个稳定可靠的基于RNA磁珠提取和数字PCR的方法，可从粪便样本中检测与EE（热带肠病）关联的人mRNA，灵敏度可达20拷贝GAPDH mRNA/200mg粪便样本。

已有报道表明病人粪便中存在人mRNA，可作为反应病人消化道病理状态的潜在标记物。然而以粪便为样本检测RNA必须克服两大挑战：一是粪便中含有大量PCR抑制剂，会严重影响PCR效率甚至PCR失败；二是粪便样本中的RNA绝大部分是微生物来源的，人mRNA含量极少。所以这项应用需要超灵敏的核酸分离检测技术。

文中使用了数字PCR对大量冻存粪便样本中多达70多个基因的表达量进行了分析，其中以GAPDH为内参，探针以VIC标记，各目的基因以FAM标记。所有70个样本都已经双塘吸收测试法检测，同时随机抽取样本用数字PCR和RT-qPCR进行检测，比较结果显示，数字PCR相对于qPCR具有更高的灵敏度。基于数字PCR的粪便样本RNA检测手段可用筛选与消化道疾病相关的核酸标记。

大家知道定量PCR是通过实时荧光信号的分析处理进而获得所谓Cq值，再根据Cq来对样品定量。Cq值容易受PCR效率，特别是PCR抑制剂影响，所以qPCR在检测靶标核酸丰度低及抑制成分高的样本时，灵敏度和准确度会大打折扣。而数字PCR通过PCR终点判断微滴阴阳性进而定量样本的方式，受PCR效率和抑制物影响非常小，特别适合诸如：

1、以粪便、血液为样本的病原微生物检测、肿瘤标记物检测；

2、以土壤、污水、淤泥、酒泥等为样本的环境生物学研究和病原微生物监测；

3、经复杂工艺制作的含大量抑制物的食品材料中转基因成分、动植物成分鉴定和含量分析，及致病微生物的检测（CIQ/CDC）；

4、以骸骨、毛发、分泌物及排泄物，或者口腔脱离细胞、动物鳞片及皮肤，陈旧标本为样本的法医学、动物遗传多样性管理及野生动物保护等涉及核酸检测分析的应用。

【Agapova S, Stephenson K, Manary M, Weisz A, Tarr PI, Mkakosya R, Maleta K, Shulman RJ, Manary M, Shaikn N. Detection of Low Concentration Host mRNA Transcripts in Malawian Children at Risk for Environmental Enteropathy. J Pediatr Gastroenterol Nutr.2012.】

近年来在小RNA的研究方面长非编码RNA（long noncoding RNA，IncRNA）的研究成为热点，IncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称。IncRNA的表达水平相对于编码蛋白的基因一般比较低，重要的是很多这些IncRNA虽然不直接参与基因编码和蛋白质合成，但是在基因转录后调控、剪切和修饰具有十分重要的功能，在很多生命活动中均起着举足轻重的作用，和疾病的发生、发展、诊断和治疗有着密切的关系，迅速成为当今分子生物学最热门的前沿研究领域之一。另外，IncRNA的亚细胞位置上也呈多样化，在细胞核、细胞质和细胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。

虽然研究甚少，但是人们逐渐认识到IncRNA具有重要的功能，因此，IncRNA的异常和疾病关系密切，将成为理解疾病、寻找疾病分子标记物、药物靶点的新的研究方向。

最近美国科学家在NUCLEC ACID THERAPEUTICS 上发表了首篇将数字PCR应用于IncRNA研究的文献。文章通过绝对定量的方式，对IncRNA分子进行直接定量，从而大致判断其对基因表达的调控属于顺式还是反式作用；同时也对不同IncRNA以及管家基因在亚细胞水平上的表达做了分析。

【David W, Dodd, Keith T. Gagnon, and David R. Corey. Digital Quantitation of Potential Therapeutic Target RNAs. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS, Volume 23,Number 2,2013.】
来自Fred Hutchinson癌症研究中心等处的研究员在《Nature Method》发表文章证明了数字PCR技术能用于不同情况下，准确，可重复性的血浆和血清microRNA（miRNA）量化检测，这将为miRNA及其它核酸用于循环生物标志物的检测铺垫了道路。

文章的第一作者，Fred Hutchinson癌症研究中心人类生物学部Muneesh Tewari博士表示，“在循环系统miRNA诊断领域，数字PCR能帮助我们进行生物标记物研究，直接比较同一实验室跨天多次实验，甚至不同实验室之间的检测结果”

实时定量PCR（qPCR）已被广泛用于血液样品miRNA的分析测试中。但是研究人员发现，血清或血浆中的miRNA qPCR测量出现了极高的差异性，无法用作稳定的血液生物标志物的检测标准，因此这一领域的研究人员一直在寻求一种能获得更可靠结果的新方法。

数字PCR具有许多优于定量PCR的优点，比如无需标准曲线，以及不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，就能获得绝对定量。

为了评估每个工作流程的步骤，包括连续稀释准备，反转录（RT）和PCR扩增，Tewari博士和他的团队分别在三个独立的工作日中，通过数字PCR嵌套分析对比定量PCR，对水和血浆中6中不同的合成miRNA各稀释系列的cDNA进行分析，结果发现比较于qPCR，数字PCR在PCR特异性变化方面，具有更高的精确度（48-72%的更少变异系数）。

接下来，研究小组进行血清miRNA的qPCR和数字PCR并列比较检测。他们收集了20例晚期前列腺癌患者，和20例年龄相匹配的男性对照血清样品，分析其中的miR-141丰度，miR-141是一种已被证明的晚期前列腺癌的生物标志物。研究人员分别在不同的三天里准备了qPCR和数字PCR分析的不同稀释浓度，并进行了检测，结果发现数字PCR相比于qPCR，能提高7倍不同一天里实验室的重复率，这在对照研究中也得到了证实：数字PCR的结果更为可信（p=0.0036 vs. p=0.1199）。

【Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari Absolut Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR. Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633.】

近期来自美国纽约西奈山医学院的科学家接连刊发了数字PCR应用于胚胎干细胞基因表达研究的最新研究成果。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）简称ES细胞。ES细胞具有细胞全能性，在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。

研究人员发现，MicroRNA-137（miR-137）在ES细胞分化为神经细胞的过程中发挥了重要的作用。科学家使用数字PCR和qPCR同时验证了在不同细胞周期条件下miR-137的表达水平，发现miR-137在细胞M期（metaphase）表达显著上调。联合其他实验证据可以表明，miR-137可以通过抑制下游转录调控因子的表达进而调节ES细胞的增殖和分化。

【Ke Jiang, Chunyan Ren, Venugopalan D. Nair MicroRNA-137 Represses Klf4 and Tbx3 During Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Research (2013) 11,1299-1313.】