Nature子刊：巧解基因编辑脱靶问题

　　科学家们发现，只需要对一种强力基因编辑工具作一个简单的改动，就能大大提高它的特异性。

　　在合成蛋白CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶(RNA-guided nucleases，RGNs)中，引导性RNA(gRNA)是一个重要的组分。麻省总医院(MGH)的研究人员发现，对gRNA的长度稍加调整，就能大幅减少预定目标之外的DNA突变。文章于一月二十六日发表在Nature Biotechnology杂志上。该研究团队去年刚刚发表文章，指出了CRISPR-Cas技术可能存在的脱靶问题。(Nature子刊：强大基因编辑工具可引起脱靶突变)

　　“我们只是简单截短了gRNA靶标区域的长度，结果发现在之前检测到的脱靶位点，脱靶突变都大幅减少，”文章的资深作者，麻省总医院的病理系研究副主任J. Keith Joung博士说。“与全长gRNA相比，一些位点的突变频率甚至减少了5,000倍以上。重要的是在靶向它们的预定目标DNA时，这些缩短了的gRNA(称为tru-gRNA)与全长gRNA同样有效。”

　　CRISPR-Cas RGN结合了被称为Cas9的DNA剪切酶，和一段与目标DNA片段匹配的短RNA。人们将其用于切割特定的DNA片段，以便进行基因改造。去年Joung的研究团队报告，CRISPR-Cas RGN会在人类细胞中发生脱靶，如果DNA片段与目标片段的差异在五个核苷酸以下，就会出现脱靶突变。这一问题大大限制了该技术在临床上的应用。为此研究人员继续进行研究，结果意外地发现缩短gRNA能够减少脱靶突变。

　　“我们去年的实验显示，gRNA互补区域一端发生几个核苷酸的错配，不会影响靶标活性，” Joung解释道。“于是我们猜想，去除这些核苷酸也许可以使整个系统对剩余序列的错配更加敏感。”

　　CRISPR-Cas RGN的基础是一种细菌用于抵御其他病原体的天然系统，最常见的用法是在gRNA中包含二十个核苷酸的靶向区域。为了测试他们的理论，MGH的研究团队通过逐步缩短gRNA，构建了一系列RGN。他们发现，17/18个核苷酸的靶向区域，能够比全长gRNA更有效地靶向预定序列。但如果gRNA的靶向区域只有15/16个核苷酸，活性就会很弱甚至完全没有活性。进一步研究显示，17个核苷酸的靶向区域能够有效在人类细胞中引入突变，其脱靶效应非常小，就算在只有一两个核苷酸错配的位点，也几乎检测不到脱靶。

　　“尽管我们还没有完全理解tru-gRNA减少脱靶效应的机制，但我们猜测原始系统拥有过多的能量，使它可以剪切不完全匹配的位点，”哈佛医学院副教授Joung说。“通过缩短gRNA，我们将能量减少到只够进行精确剪切的水平，令核酸酶无暇剪切脱靶位点。这其中的具体机制还有待进一步实验的验证。”