Nature子刊：武汉大学团队开发基于水凝胶的分子张力荧光显微镜

　　细胞外基质(ECM)刚性是影响多种生物过程的重要机械线索。然而，对刚性传感的分子机制的理解受到当前细胞力测量技术的空间分辨率和力灵敏度的限制。

　　2023年10月5日，武汉大学刘郑团队在Nature Methods 在线发表题为“Hydrogel-based molecular tension fluorescence microscopy for investigating receptor-mediated rigidity sensing”的研究论文，该研究开发了一种以可控和可靠的方式在软水凝胶表面功能化DNA张力探针的方法，使分子张力荧光显微镜能够进行刚性传感研究。

　　研究结果表明，成纤维细胞对底物刚性的反应是通过募集更多承受力的整合素和调节ECM的整合素采样频率，而不是简单地超载现有的整合素-配体键，以促进局点粘附成熟。还证明了ECM刚性正调节T细胞受体-配体键的pN力和T细胞受体机械采样频率，促进T细胞活化。因此，在标准共聚焦显微镜上实现的基于水凝胶的分子张力荧光显微镜提供了一种简单有效的方法来探索依赖于刚度的生物过程的详细分子力信息。

　　作为一种主要的机械信号，细胞外基质(ECM)刚性已被证明影响许多关键的生命过程，包括干细胞分化、血小板活化和肿瘤转移。为了了解细胞如何感知和响应ECM刚度，牵引力显微镜(TFM)或微柱阵列已被广泛应用于测量细胞粘附在软水凝胶表面所施加的机械力。例如，Prager-Khoutorsky等人发现基质硬度可能通过影响成纤维细胞中局灶粘连(focal adhesion, FAs)的机械转导来改变成纤维细胞的极化。

　　Plotnikov等利用TFM研究了单个成熟FAs在不同刚度的水凝胶上产生的牵引力分布和动力学，发现单个FAs可以对ECM施加波动牵引力，探测基质刚度，促进细胞硬化。此外，在利用TFM研究水凝胶硬度与细胞牵引力之间的复杂关系后，研究人员提出，细胞通过一种称为分子离合器(molecular clutch)的“actitinadaptor protein-integrin-ECM”连锁传递和调节FAs介导的机械转导。虽然TFM极大地促进了机械生物学领域的发展，但TFM较粗的力灵敏度(纳牛顿)和~微米的空间图像分辨率可能限制了人们对刚度感知的分子机制的理解，即细胞感知和响应其环境刚度的能力。

　　Stabley等人最近率先发明了分子张力荧光显微镜(mTFM)，该技术采用固定化的机械敏感荧光分子探针来成像和量化活细胞膜受体所经历的pN水平的力。利用mTFM，研究人员能够实时成像活细胞中整合素和T细胞受体(TCRs)等跨膜受体的分子力，并揭示了~pN水平的力通过单个受体介导的细胞粘附和T细胞活化传递。最近，作者开发了一种可逆剪切DNA张力探针(RSDTP)，扩大了可逆分子张力探针的力测量范围，并揭示了机械强整合素(>56 pN)维持FA成熟。虽然mTFM可以在分子水平上测量细胞力，但该技术目前仅限于研究在覆盖层或脂质双分子层上扩散的细胞，这些细胞在机械上与软ECM不同。目前很难用mTFM来绘制刚性传感过程中的分子力，这主要是由于水凝胶复杂的化学和物理结构性质，这使得在其表面特异性地修饰分子张力探针具有挑战性。

基于水凝胶的mTFM方法（图源自Nature Methods ）

　　该研究开发了一种实验程序，以可控和可靠的方式在软水凝胶表面功能化DNA张力探针。此外，荧光纳米球被共轭在同一个水凝胶表面，这使人们能够将mTFM与传统TFM耦合，并收集更全面的数据，包括分子力图，净细胞牵引力和力取向。使用基于水凝胶的mTFM，作者研究了ECM刚度如何调节受体介导的力传递过程。

　　研究发现，成纤维细胞对底物刚性的反应主要是通过募集更多的承受力的整合素和调节整合素在ECM中取样的频率，而不是通过增加FAs的整合素力的平均大小。此外，也发现ECM刚性对参与TCR -配体相互作用和TCR机械扫描动力学的pN力有积极影响，这最终促进了T细胞响应抗原识别的激活效率。该研究表明，基于水凝胶的mTFM可以用于研究细胞在软水凝胶上扩散的机械转导过程，软水凝胶在机械上更类似于组织，并可能为细胞刚度感知和机械转导的分子机制提供新的见解。