Nature子刊：第三代测序技术或将迎来新升级

　　第三代测序技术，即单分子测序技术，又称纳米孔测序，以美国太平洋生物（Pacific Biosciences）的 SMRT 技术为代表。DNA 测序时，不需要经过 PCR 扩增，实现对每一条 DNA 分子的单独测序。

　　SMRT 测序面临的一个挑战是将更长的 DNA 分子放入 100 纳米大小的零模波导孔（ZMW）。目前，DNA 模板必须通过生物亲和素固定到 ZMW 上，DNA 分子会以自己的方式扩散到 ZMW，而这个过程更利于短 DNA 片段。多年来，PacBio 公司一直在改进工艺，但所需 DNA 样本量仍然高于纳克水平。

　　近日，PacBio 公司和美国东北大学的研究人员证明，纳米孔与 PacBio 测序系统结合的技术经改造后，可以优先加载长 DNA 分子，并且减少所需 DNA 样本量。

　　9 月 11 日，该研究发表在 Nature Nanotechnology（IF：38.986），这是由美国国家人类基因组研究所资助的一项为期 3 年的研究项目成果之一。

　　该研究小组 2014 年公布了这项工作的第一个成果，成功构建了混合纳米孔和 ZMW 的配置，DNA 可以通过这个结构载入测序系统。现在，研究人员证明该方法是可行的，长 DNA 分子也可以测序并读出，更重要的是，所需 DNA 样本量少于通常 PacBio 测序所需样本量。

　　美国东北大学物理学副教授、该研究的资深作者 Meni Wanunu 表示：“这仍然是一个概念证明”。研究团队与 PacBio 公司合作的目标是找出一种方法减少系统所需 DNA 样本量并优先加载较长 DNA 分子。

　　如何达到这样的目的呢？

　　Wanunu 团队的办法是在每个 ZMW 底部设置纳米孔制成 NZMWs，并施加电压驱动 DNA 通过纳米孔。Wanunu 说，这样的结构能够大量加载 DNA 并优先加载更长的 DNA 片段。

　　研究小组利用六个 NZMWs 进行试验，研究了从 1kb 到 48.5kb 的 DNA 片段如何被 NZMWs 捕获。团队证明，10 皮克的 DNA 样本可以在不到一分钟的时间加载完成。而传统方法加载 10kb 的 SMRTbell 样品需要输入 1.5 微克的 DNA，要花费 1 小时。

　　传统 PacBio 测序，DNA 模板是与 DNA 聚合酶链亲和素融合蛋白结合在一起，然后蛋白结合波导上的生物素基团，进行测序。研究小组证明可以在 NZMWs 构建类似 DNA 聚合酶链复合物捕获 DNA，进行测序。

　　NZMW 与 ZMW 相比有什么优势？

　　研究人员比较了 NZMW 与 ZMW 测序情况。添加模板 DNA 与荧光标记的核苷酸，测试了 72 个基本的环状 DNA 和 DNA 聚合酶模板。研究人员使用电压脉冲将聚合酶激活，进行荧光测序，发现荧光光阵只出现在 NZMWs，也就是说在短短的 3 秒加载时间内，DNA 模板就被加载到 NZMWs，而没有 DNA 被加载到 ZMWs。

　　最后，研究人员展示了一个已知的 20kb SMRTbell 序列的测序。他们用不到 1 纳克的 DNA 样本，施加 2 秒电压脉冲，就将 DNA 加载到了 NZMW。

　　Wanunu 说，团队下一步将继续优化设计包括放大 NZMW 设计，为每个 ZMW 纳米孔构建晶片，使每个 NZMW 不需要单独制作。

　　此外，Wanunu 团队也与 PacBio 合作开发直接 RNA 测序技术。Wanunu 表示，计划把研究重点放在用 NZMW 装置进行直接 RNA 测序，“一旦达到 DNA 和 RNA 的高质量测序目的，我们就可以与 PacBio 的仪器一体化，这之前，我们还有一段路要走。”

　　PacBio 的首席科学官 Jonas Korlach，拒绝讨论该公司是否计划将 nanopore ZMWs（NZMWs）作为其商业平台的技术优化方向。他声明，在 Nature Nanotechnology 发表的研究不以任何方式反映任何有关当前或未来 SMRT 测序平台商业实现或特点的预测。