NatureMethods：大规模定点突变的新方法

　　定点突变是序列-功能研究中不可或缺的工具。然而，传统的方法能力有限。华盛顿大学的研究人员开发出一种新方法，能够以大规模并行的方式开展单个氨基酸的定点突变。这项成果于1月5日发表在《Nature Methods》杂志上。

　　目前的定点突变方法能力有限，每次只能靶定几个碱基，且操作繁琐，成本高昂。为了克服这些限制，华盛顿大学Jay Shendure领导的团队开发出一种名为PALS（programmed allelic series）的方法，将基于芯片的DNA合成与重叠延伸突变相结合，以大规模并行的方式在每个cDNA模板引入单个突变。

　　首先，研究人员在芯片上合成突变引物，每条引物的中心附近有一个突变。这些引物的两侧带有接头，这样可利用PCR去除。随后将引物与野生型的正义链退火并延伸，并降解底物，扩增突变体。在接头被剪掉后，大引物沿着野生型目的基因的反义链延伸。随后降解底物，产生全长的单突变拷贝，并通过PCR扩增。

　　为了获得全长序列，Shedure及其同事克隆突变的文库，在每个克隆上添加一个随机条形码，并开展分层标签指导的测序，获得一组一致单体型及相关标签。

　　作为概念证明，研究人员以酵母转录因子Gal4的DNA结合结构域（DBD）为模板，构建PALS文库。他们针对结构域中的每个密码子，将其替换成编码其他氨基酸的密码子或提前终止密码子。研究人员发现，~47%的全长单体型有且只有一个编程的突变。在这些“干净”的克隆中，99.9%的单密码子替换至少观察到一次，而99.7%至少观察到五次。

　　研究人员随后转到p53，看看他们的方法是否能扩展到靶定全长cDNA。与Gal4实验不同，他们这一次通过简并密码子来替换p53的密码子。结果，他们报告了较低的单突变单体型（33%），研究人员认为这可能是由于较长模板的二次错误概率增加。不过，研究人员仍然在干净的单突变克隆中观察到93.4%的氨基酸替换。

　　Shendure及其同事指出，总的来说，PALS的突变覆盖度基本上是均一的，不过略为偏向N端，这在Gal4和p53研究中都观察到。

　　研究人员还利用PALS开展了Gal4的深度突变扫描。他们将Gal4 DBD文库引入双杂交的报告系统。其中，Gal4基因被去除，替换为HIS3基因，它处于GAL1启动子的控制之下。如果Gal4 DBD突变体能够与DNA结合并激活转录，那么HIS3表达，则系统能够在缺乏组氨酸的培养基中生长。他们发现，在选择但不是许可的条件下，提前终止密码子是有害的，大约三分之一的残基无法忍受突变。

　　Shendure及其同事表示：“PALS突变、功能选择和深度测序的组合为解析人类基因的等位基因异质性提供了一个通用框架，也有助于对越来越多的意义不明的变异进行功能注释。”