Nif对花粉管微丝骨架介导的胞吞、胞吐作用的调节

实验概要

了解Nif对花粉管微丝骨架介导的胞吞、胞吐作用的调节作用。

主要试剂

FM4-64 (Molecular Probes，Inc. Eugene，OR)用DMSO溶解，配制成200µM的母液，-20℃避光保存。

主要设备

摇床

激光共聚焦显微镜（ZEISS，META550）

JEM-1230电子显微镜（JEOL Ltd. Tokyo，Japan）

实验材料

白皮松花粉

实验步骤

1. 材料培养
分别称取10mg白皮松花粉，置于以下两种培养基，25℃条件下摇床(120rpm)暗中培养72h。培养基中所含DMSO浓度低于1%，该浓度对于花粉萌发和花粉管生长无影响。

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 250µM Nif

2. FM4-64的装载及共聚焦显微镜观察

取不同培养基72h的白皮松花粉管溶液200µl，加入5µl  FM4-64母液，立即混匀，此时FM4-64的终浓度为5µM。孵育10s后，将材料滴于载玻片上，立即在激光共聚焦显微镜下观察，激发波长488nm，发射波长是514nm，连续采集图像。上述操作在黑暗或弱光条件下进行。

3. 胞吞作用能量依赖性检测
标准培养基培养72h的花粉管，首先用500µM叠氮化钠处理10min，随即用上述相同浓度的FM4-64标记，按上述操作进行。

4. FM4-64专一性膜质标记检测
培养72h的白皮松花粉管用FM4-64标记，1min后用25%(W/V)的山梨醇处理10min，使花粉管发生细胞质壁分离，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。

5. 电镜观察

1) 培养72 h的白皮松花粉管用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)过滤冲洗，收集

2) 立即用2.5%戊二醛固定4h；固定液用0.2M磷酸缓冲液(pH 7.2)配制，并加入2%(w/v)蔗糖。

3) 0.1M磷酸缓冲液冲洗3-5次，每次0.5 h；

4) 1%锇酸再固定4h

5) 0.1M磷酸缓冲液冲洗3-5次，每次0.5 h；

6) 系列乙醇脱水，环氧丙烷过渡，Spurr树脂包埋；

7) LKB-V超薄切片机切片，切片厚度为75 nm；

8) 2%醋酸双氧铀(w/v)染色40 min；0.5%柠檬酸铅隔绝空气染色30 min；

9) JEM-1230电子显微镜80kV下观察、拍照。

6. 花粉管微丝的标记

应用不同浓度Nif处理的花粉管在新鲜配制的4%多聚甲醛(50mM Pipes buffer，pH  6.9)固定1h，固定时同时抽气几分钟。用50mM Pipes buffer洗涤三次，花粉在含有1%果胶酶和1%纤维素酶的50mM Pipes  buffer37℃下孵育15min。用50mM Pipes buffer洗涤三次后，样品再用1%Triton  -100室温孵育40min。50mM Pipes buffer洗涤三次后，样品用0.2 nM phalloidin-TRITC溶于PBS (pH  6.9) buffer暗处理1  h。滴入50%甘油(含抗荧光淬灭剂)，用指甲油封片。在激光共聚焦显微镜下，Ar/Kr激光，激光波长515nm。每个样品取20－30个不同光学切片扫描，最后将所有光切面的图象叠加成像。