A． 载体选择
为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。
B. 目的DNA序列与载体连接
从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。
试剂及其制备
T4 DNA连接酶
连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水（SDW）
试验程序
1． 建立以下反应体系（终体积20μl）：
4μl 质粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 连接缓冲液
2μl DNA 连接酶
6μl 无菌蒸馏水
2． 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。
3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。
注意事项
1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。
2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。
3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。
C．感受态细胞制备（CaCl2法）
试剂及其配制