P81磷酸纤维素膜吸附实验

P81 膜具有离子交换的特性，在较大 pH 范围内带有负电荷。在低 pH 条件下（如在本方案中用于洗膜的 75 mmol/L 正磷酸），激酶分析中过量的 [γ-³²P] ATP 并不与 P81 膜结合，而在此条件下带正电荷的磷酸化多肽可结合在膜上。

碱性蛋白质比酸性蛋白质更适合吸附在 P81 膜上。组蛋白与膜的结合力较强，因为它是强碱性的，而酪蛋白的结合力很差，几乎为零，因为它是较为酸性的蛋白质。

样品

正磷酸丙酮

P81 磷酸纤维素膜500 ml塑料杯（其底被抗溶剂塑料或金属网替换）20 ml 闪烁瓶闪烁计数器

1. 将膜裁成 2 cm × 2 cm 大小的小块，在一端折叠，如图 17.7.1，用铅笔标记折线。将膜放置在一块大的无吸收性的物质上，如塑料、丙烯酸膜或铝箔包被的纤维板。

2. 从每个样品管中吸取 15 μl 或 30 μl 样品迅速滴在 P81 膜上。迅速将这些膜放置于带抗溶剂塑料或金属网底的 500 ml 塑料杯中（图 17.7.2）。

3. 将此杯放入盛有 75 mmol/L 正磷酸和搅拌子的更大烧杯中，搅拌 5 min。

4. 将已使用的正磷酸洗液倒入可收集放射性废料的容器中。重新将 75 mmol/L 正磷酸倒入大烧杯，搅拌 5 min 以上，重复以上清洗步骤，共洗 5 次。

5. 以丙酮充满大烧杯，洗 P81 膜 5 min，弃丙酮，使膜干燥。

6. 将每个 P81 膜放入 20 ml 闪烁瓶中进行 Cerenkov 射线计数。

1. 通常为了确保信号能被检出，将 50%～75% 的反应终产物滴在P81膜上。

2. 如果杯中的塑料网不能抗溶则会被丙酮洗液溶解。

3. 假如想获得绝对 dpm 值且闪烁计数器可得 ³²P 的衰变曲线，可加入闪烁液计数。