PCR的作用原理和过程

技术原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝.在 聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链.因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制.
　　但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展.发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床.
工作原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.
PCR反应的基本过程标准的PCR过程分为三步
　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下,
　　氢键断裂,形成单链DNA
　　2.退火（复性）（25℃-65℃）：系统温度降低,引物与
　　DNA模板结合,形成局部双链.
　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右zui佳的活
　　性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延
　　伸,合成与模板互补的DNA链.
　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍.
　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.