PCR基因扩增仪的原理+分类+操作+常见故障

　　一、原理

　　PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。

　　二、分类

　　1. 普通的PCR仪

　　一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，又叫传统的PCR仪。

　　用途：主要是做一些简单的、对单一退火温度的目的基因进行扩增。

　　（1）梯度PCR仪： 一次PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度)，通常为12种温度梯度的普通PCR仪。

　　用途：研究未知DNA退火温度的扩增。

　　（2）原位PCR：将具有细胞定位能力的原位杂交技术运用于从细胞内靶DNA的定位分析，在细胞内实现基因扩增的普通PCR仪。

　　用途：用于在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。

　　2. 实时荧光定量PCR仪

　　PCR扩增时加入的引物利用荧光素进行标记，使引物和荧光探针同时与模板进行特异性结合，扩增结果通过荧光信号采集系统实时采集信号并输送到计算机分析处理系统，实时输出量化结果，这样的PCR仪叫实时荧光定量PCR仪。

　　（1）金属板式实时定量PCR仪

　　可作为普通PCR仪使用

　　可带梯度功能

　　可容纳的样本量大，无需特殊耗材

　　温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致

　　（2）离心式实时定量PCR仪

　　温度均一性较好

　　使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差

　　可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能

　　（3）各孔独立控温的定量PCR仪

　　不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。

　　SmartCyclerⅡ的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。

　　SmartCyclerⅡ上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。

　　三、操作规程

　　普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。

　　定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。

　　四、常见故障

　　①荧光染料污染样品孔；

　　②PCR管融化，原因可能是温度传感器出问题或是热盖出问题；

　　③个别孔扩增效率差异很大，可能的原因是半导体模块出现坏点；

　　④荧光强度减弱或不稳定，产生的原因有滤光片发霉或有水汽，或光源损耗（以卤钨灯为光源的），需更换光源；或需调节检测元件灵敏度；

　　⑤仪器工作时出现噪音。

　　以上故障部分可自行检查，部分需工程师检修。