(1)扩增效率低: 优化反应条件；设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应等。
(2)模版降解或模版浓度太高。
(3)试剂灵敏度不好：更换更高灵敏度、抗干扰的试剂。
(4)检测基因结构复杂：高GC、复杂二级结构和长片段模版，都会影响PCR扩增。
(5)扩增产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。
