PCR实验操作

PCR实验操作

    PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiple cloning sites两边的序列，选用适当的核酸引子 （universal primers） 进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP，所增殖的DNA即被32P或DIG所标定，所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

    仪器用具：微量离心机；PCR 反应器

    药品试剂：

    模版DNA： pBlueGus 质体DNA （~50 pg）

    核酸引子对： T3 promoter primer 与T7 promoter primer （各2 μM）

    矿物油 （是否需要视PCR反应器机型而定）

    PCR DIG probe synthesis kit （Roche）, 内含：

    TaqDNA polymerase （Expand High Fidelity, 3.5 U/μL）

    10×PCR DIG probe synthesis mix （2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0）

    Expand high fidelity buffer with MgCl2 （10×）

    方法步骤：

    以下反应条件主要参照PCR DIG probe synthesis kit 制造厂商所提供的产品说明。

    1）  取一支0.5 mL微量离心管，依下表逐一加入各项试剂 （单位 μL）：

    2） 以手指头轻弹管壁使各项试剂混合均匀。

    3） 短暂离心后，徐徐加入100 μL 矿物油。

    ◆ 有些PCR 反应器不需使用矿物油。

    4） 在PCR 反应器上设定PCR 反应条件：Denaturation： 94℃/10 min

    扩增反应：

     30 循环的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]

    zui后的elongation step：72℃/10 min

    5） 将微量离心管移至反应器上，并开始进行PCR 反应。

    6） 反应完成后，以微量移液器吸出矿物油，并取出5 μL PCR 反应产物，进行洋菜胶体电泳分析。