PCR常见问题及解决方案

PCR常见问题及解决方案

　　1没有扩展条带

　　可能的原因及对应的解决方案如下：

　　酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

　　模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

　　变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

　　反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5~10分钟。

　　引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

　　引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

　　DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

　　2PCR产物量过少

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

　　DNA模板量太少。增加DNA模板量。

PCR循环数不足。增加反应循环数。

　　引物量不足。增加体系中引物含量。

　　延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

　　变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

　　DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

　　3扩增产物跑电泳条带弥散

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

　　dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

　　MgCl₂浓度过高。可适当降低其用量。

　　模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

　　引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

　　循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

　　退火温度过低。

　　电泳体系有问题：

　　①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

　　②凝胶没有凝固好；

　　③琼脂糖质量差。

　　若为PCR试剂盒则可能：

　　①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

　　降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

　　4扩展产物出现杂带

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

　　循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

　　酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

　　退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

　　样品处理不当。

　　Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

　　若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

　　复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

　　反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

　　引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

　　引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

　　模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

外源DNA污染。确保操作的洁净。

　　5条带大小与理论不符

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

　　模板或引物使用错误。更换引物和模板。

　　基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

　　6阴性对照出现条带

可能的原因和对应的解决方案如下：

试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。