PCR扩增产物的克隆——平端连接法

平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性）。

如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5'→3'校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。

这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。

对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。

模板DNA

SauIKlenow片段T4连接酶

移液器移液器吸头PCR小管DNA扩增仪电泳槽电泳仪台式高速离心机

一、PCR反应

1.  依次混匀下列试剂

（1）H₂O：35 ul

（2）10×PCR反应缓冲液：5 ul

（3）25 mmol/L MgCl₂：4 ul

（4） 4种dNTP：4 ul

（5）上游引物（引物1）：0.5 ul
 

（6）下游引物（引物2）：0.5ul

（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 ul

（8）混匀后离心5秒。

2.  将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5  ul 约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3.  用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

二、电泳

取10  ul 扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。

1.  酚/氯仿法

（1）取反应产物加100  ul TE。

（2）加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。

（3）再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。

（4）在水相中加300  ul 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。

（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH₂O 中，待用。

2.  Wizard PCR DNA纯化系统

Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。

（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。

（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。

（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。

（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。

（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。

（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。

（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50  ul TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。

（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。

四、载体加dT尾

1.  将1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.  在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 ul 4种dNTP改为4 ul 25 mM dTTP。

3.  加入1 ul(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。

4.  按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。

5.  加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。

6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体粘末端连接

1.  在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。

2.  加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。

3.  取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1.  在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。

2.  37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。

3.  用酚:氯仿抽提2次。

4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH₂O中。

5.  质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。

6.  取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

1.  PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。

2.  PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。

3.  吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。

4.  加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

5.  应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

6.  纯化树脂在使用前必须充分混匀。

7.  PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。

一、 PCR反应中的主要成份

1.  引物
 

PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。

（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。

（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。

（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。

（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。

（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 umol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。

2.  4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。

（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 umol/L。

（3）理论上4 种 dNTP各20 umol/L，足以在100 ul 反应中合成2.6 ug的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

3.  Mg²⁺

（1）Mg²⁺浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

（2）通常Mg²⁺ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg²⁺ 进行预备实验，选出最适的Mg²⁺浓度。

（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg²⁺ 离子浓度的物质，以保证最适Mg²⁺ 浓度。

4.  模板

（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。

（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1 ug的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。

（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。

（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

5.  Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。

Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2x 10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 ul PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。

所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。

反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：

（1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。

（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg²⁺ 。

（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。

6.  反应缓冲液

（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg^₂₊ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。

（2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 ug/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。

（3）各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。