PCR扩增产物的克隆——TA克隆法

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5'除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3'OH末端与5'端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

外源DNA片断

pMD 18-T VectorLigation bufferT4 ligateaserATP

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一、大肠杆菌感受态细胞的制备

1.  取大肠杆菌JM109保存液50 ul，接种于4 ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300 rpm振荡培养过夜，第二天取50 ul 转接到新的4 ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，冰浴10 min。

2.   4℃，5 000 rpm离心2 min，去上清液。

3.  加入750 ul预冷的0.1 M CaCl₂重悬菌体，冰浴30 min。

4.   4℃，5 000 rpm离心2 min，弃上清液。

5.  加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl₂轻轻重悬菌体，冰浴2 h后，4℃保存备用。

二、重组DNA的转化

1.  将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

2.   于100 ul感受态细胞中加入10 ul连接产物，冰浴30 min。

3.  将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2 min。

4.  在离心管中加入SOC培养基300 ul，枪头混匀，37℃、150 rpm温和摇振60 min。

5.  将200 ul 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。

三、重组质粒的鉴定

方案一： 菌落PCR

（1） 制备PCR混合液。

（2） 用经灭菌的10 ul 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。

（3） 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。

（4） 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。

（5） 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。

（6） 取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

方案二： 质粒PCR

1.  碱裂解法少量制备质粒DNA

（1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。

（2）用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。

（3）加入250 ul Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO₂中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

（4）加入400 ul Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2 min，14 000 rpm离心10 min。

*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。

（5）将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm离心1 min。

（6） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 ul Buffer W1，5500 rpm离心1 min。

（7）弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700 ul 已加无水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm离心1 min，以同样的方法再用700 ul已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。

（8） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm离心1 min。

（9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去离子水。

（10）室温静置2 min，14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。

（11） 取5 uL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。

2.  抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

（1） 加TE稀释质粒DNA溶液至300 uL。

（2）加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3 min。

（3）14 000 rpm 离心5 min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3 min。

（4） 14 000 rpm离心5 min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3 min。

（5） 14 000rpm离心5 min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15 min，沉淀质粒DNA。

（6） 14 000rpm离心13 min，弃上清液，沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。

（7） 取5 ul样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

3.  质粒PCR

（1） PCR反应体系如下：

（2）PCR 扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：

94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。

（3） 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。

1.  要获得目的基因的TA克隆 ，PCR 产物的特异性要好。

2.  PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。

3.  在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。

4.   制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。

5.  42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。

6.   菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

8.  Ligation Solution I 请于冰中融解。

9.  在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。

10.  克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

11.  按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。

12.   连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。

13.   连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

14.   感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。

一、常见问题

1.  怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?

（1） 纯化PCR产物，切胶回收的PCR片段最好。

（2）除去残存的引物等杂质。

（3）DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。

2.  PCR产物难以插入载体，为什么?

（1）确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长，长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。

（2）PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

（3）确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

（4）确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。

（5）确认抗生素的浓度是否过大。

（6）最好使用新配制的平板培养基。

3.  转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色)，为什么?

插入的PCR片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacZ基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

4.  插入的PCR产物进行测序时，可使用何种引物?

本制品的载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的引物都可以使用。