（1）引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
（2）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
（3）反应条件不够优化：可调整退火温度或改为三步扩增法。
（4）反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
