PDL1的糖基化和三阴性乳腺癌的免疫治疗

　　一、前言

　　几十年来癌症的治疗一直受到了科学家的极大关注。乳腺癌的治疗在过去20年内得到了极大程度的发展，虽然该疾病的死亡率大幅度降低，但该疾病的发病率仍然非常高。在各类乳腺癌中，“三阴性乳腺癌”因为缺少治疗靶标（如雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2），一直是治疗的难点。令科学家感兴趣的是：“三阴性乳腺癌”肿瘤里具有最多的肿瘤浸润性淋巴细胞，这些淋巴细胞被推测有助于抵抗肿瘤生长，然而三阴性乳腺癌会使肿瘤中的淋巴细胞沉默或失活。这也给我们一个提示，对于三阴性乳腺癌，如果我们使用免疫治疗方法激活杀伤肿瘤的淋巴细胞活性，将会是一个新的治疗策略。

　　二、什么是免疫抑制机制

　　该讲座先介绍了最重要的一种免疫抑制机制，即“PD-L1和PD-1作用机制”。癌细胞在细胞表面表达PD-L1，PD-L1将会链接T细胞的PD1，这种关联将最终关闭T细胞的活性，也就是发生“免疫逃逸”。科学家现在开发了单克隆抗体，可以专一性地识别癌细胞上的PD-L1或T细胞上的PD-1。这种策略将有助于掩盖这两种分子的相互作用的表面，因此可以阻断PD-L1和PD-1的链接，从而重新激活T细胞的活性，允许T细胞识别癌细胞，然后清除这些它们。目前，这类治疗的整体响应率在大概20%-40%。演讲者判断“三阴性乳腺癌”一定存在类似的免疫抑制机制。

　　图1.PD-L1和PD-1作用机制

　　本讲座通过研究三阴性乳腺癌细胞的PD-L1的糖基化和稳定性，探索了用单克隆抗体阻断“免疫逃逸”的机制，及研发出新的“抗体和药物结合物（ADC）”来治疗三阴性乳腺癌。

　　三、实验方法及结果

　　演讲者先研究了癌细胞上的PD-L1，想弄明白PD-L1表达在癌细胞的哪个部位？因为PD-L1的分子量为33千道尔顿，而Western Blot实验表明，33千道尔顿的蛋白质表达是非常少的，而50千道尔顿的蛋白质表达非常多。经过一系列的基因敲除实验，证实这个高分子量的蛋白就是PD-L1信号，是高度糖基化的PD-L1。用突变方法发现PD-L1只在其细胞外区域的4个NXT结构域上发生了糖基化。

　　为了验证糖基化的PD-L1和PD-1的相互作用，演讲者使用IncuCyte活细胞动态成像系统对PD-L1和PD-1之间的动态变化进行定量。向有糖基化PD-L1的癌细胞（红色核标记）溶液中加入绿色荧光标记的PD-1蛋白质，在处理后12个小时的时候，细胞表面有大量的绿色聚集，说明PD-L1和PD-1有相互作用。而对于非糖基化的PD-L1的稳定克隆，并没有看到很多的绿色荧光，这意味着PD-L1和PD-1在12个小时之后没有相互作用。结果显示这个糖基化结构是蛋白相互作用所必须的。

　　图2.用IncuCyte成像仪对PD-L1和PD-1之间的动态变化进行定量

　　为了理解糖基化的功能，演讲者再次使用IncuCyte成像仪来模拟T细胞存在时癌细胞和T细胞的动态相互作用。在此例中，对于BT549核IP细胞，加入活化的T细胞，共同孵育5天时间，用表示Caspase 3活性的绿色荧光表示癌细胞的凋亡。只要癌细胞开始死亡，就可以看到红色荧光的减弱和绿色荧光的增强。结果表明：糖基化PD-L1的癌细胞对T细胞杀伤具有抵抗作用，而非糖基化的癌细胞对T细胞杀伤非常敏感。

　　图3.用IncuCyte成像仪来模拟T细胞存在时癌细胞和T细胞的动态相互作用

　　下一步，演讲者想了解调控糖基化的上游信号是什么？他们将两种三阴性乳腺癌细胞BT549和BT468，用不同的刺激物，如EGF，IGF，HGF，FGF和TGFβ处理。发现EGF可以一致地诱导两种三阴性乳腺癌细胞的PD-L1的糖基化。糖基化的PD-L1很稳定，而非糖基化的PD-L1半衰期很短。上游信号EGF，可以增加PD-L1的糖基化形式。所以如果我们抑制EGFR信号，我们就可以使同源动物模型中的三阴性乳腺癌细胞对“抗-PD-1”的治疗敏感。

　　另一个发现是：三阴性也会诱发慢性的炎症。他们想了解为什么这些炎症会引起癌症的发展。演讲者发现，在肿瘤微环境中，巨噬细胞具有分泌TNFα（肿瘤坏死因子α）的能力，而TNFα会识别癌细胞的TNFα受体。TNFα将活化NF-kappaB，并且引起p65的核转移，然后开启CSN5的表达。CSN5是一种泛素化酶，该酶将稳定PD-L1，诱导癌细胞的免疫抑制功能，促进癌细胞的发展。

　　演讲者与药厂合作，开发抗糖基化PD-L1的抗体。他们将糖基化的PD-L1作为抗原接种在小鼠上，创造了3,000个杂交瘤克隆。然后用流式细胞仪筛选这3,000个克隆，努力寻找能特异性识别糖基化PD-L1，而不识别非糖基化PD-L1的抗体。然后用IncuCyte成像仪进一步揭示哪个抗体具有阻断PD-L1和PD-1相互作用的功能。他们使用了Essen BioScience的技术和pHrodo吞噬系统，来研究抗体是否能结合糖基化的PD-L1，然后诱导这个PD-L1的内部化，并进入溶酶体被细胞降解。演讲者将STM108抗体用荧光染料标记上荧光。当细胞开始吞噬这些抗体时，IncuCyte成像仪中将会观察到红色荧光。在此例中，当他们将STM108抗体加入PT549的稳定克隆中时，可以看到在12个小时的过程中能诱导出很漂亮的红色荧光，暗示STM108抗体可以特异性地内化到癌细胞中去。然后在处理5天之后做了Western Blot，可以发现大量的PD-L1减少了，暗示PD-L1发生了降解。

　　图4.用IncuCyte成像仪观察pHrodo吞噬系统，暗示STM108抗体可以特异性地内化到癌细胞中去。

　　演讲者又研究了抗体和药物结合技术，挑选MMAE作为弹头，将细胞毒性的药物结合到抗体上。当小鼠具有PD-L1表达，用“抗体药物结合物（ADC）”处理之后，它们的肿瘤生长发生了显著降低。当用糖基化ADC抗体处理之后，4T1-hPDL1肿瘤也不再生长。当小鼠用糖基化的MMAE抗体处理后，可观察到肿瘤微环境中产生强烈的红色荧光，表示Caspase 3的活性增加，细胞发生凋亡。一旦发生内吞事件，PD-L1蛋白将进入溶酶体并被降解，随着抗体和PD-L1的降解，针对癌细胞的细胞毒性药物就会被释放，然后杀伤PD-L1高表达的癌细胞。这也会产生“旁观者效应”，可清除不表达PD-L1的癌细胞。

　　图5.观察肿瘤微环境中的红色荧光，表示Caspase 3的活性增加

　　四、结论

　　基于他们的信号分析，演讲者可以设计策略，努力分离能特异性识别糖基化PD-L1的单克隆抗体。他们第一次发现这个抗PD-L1抗体可以交联结合在膜上的“PD-L1”分子，并且诱导这个蛋白的内吞作用，因此可以让抗体携带细胞毒性药物，通过内吞释放该药物，杀死癌细胞，引发对三阴性乳腺癌的深远的疗效。