PeerJ：如何利用NGS来分析濒危物种

　　 美国鼠兔（American pika）是一种可爱的小动物，圆滚滚，萌萌哒，人称美国皮卡丘。由于它们对高温非常敏感，故栖息在又高又冷的山区，而随着全球气候变暖，它们逐渐向更高的山区迁徙。这就为鼠兔的研究带来了难题。

　　对于这个濒危物种，研究人员不能采取强硬的手段来捕获，而只能依靠非侵入性采集的样本，比如毛发或粪便中的DNA。由于这些样本中只含有少量的DNA，新一代测序技术是否适用，这可是个问题。

　　近日，加拿大英属哥伦比亚大学的研究人员给出了肯定的答复。他们通过新一代测序分析，鉴定出美国鼠兔样本中近4,000个SNP，发现该物种的遗传变异随着海拔的变化而变化。这项成果发表在《PeerJ》杂志上。

　　英属哥伦比亚大学的副教授Michael Russello及其同事利用非侵入性的陷阱，从华盛顿州的北瀑布国家公园采集了12只鼠兔的毛发样本。研究人员称，这些样本的平均起始DNA浓度为0.55 ng/μl，而有些样本的DNA量甚至低于1 ng。

　　他们采用nextRAD（Nextera-tagmented, reductively-amplified DNA）基因分型技术从美国鼠兔的样本中收集SNP数据。这种Nextera tagmentation技术来自Illumina，它以转座酶为基础，同时完成DNA的片段化和接头的添加，大大减少了所需的DNA起始量。他们从每个样本中平均获得1,863,634个测序读取。

　　为了确保这些DNA来自鼠兔，他们将测序读取定位回鼠兔（Ochotona princeps）基因组，发现16个样本的相当一部分读取对应了其他的小型哺乳动物，还有2个与人类匹配，1个来自玉米。

　　在其余67个样本中，研究人员发现了3,803个SNP，而异常值检测发现37个位点在一个样带，18个在另一个样带。其中5个位点与已知功能的基因相关，包括ROR2基因，它参与了骨骼和神经发育以及细胞运动和细胞极性；HEPHL1基因，它似乎是铁氧化酶；以及TMX4，一种跨膜蛋白。

　　研究人员指出，多态性位点的比例随采样点的不同而变化。与海拔中等和较高的点相比，在海拔较低的点采集的样本也有着较少的多态性位点。他们认为，样带上的基因多态性也有着类似的趋势。“我们发现遗传变异与海拔显著相关，海拔较低的地方也表现出较低的多态性水平，”研究人员写道。

　　在金字塔峰（PP）样带的较低和中等海拔的点，研究人员发现了明显的近亲繁殖，不过在较高海拔的点却没有发现。同时，桑顿湖（TL）样带的所有点都表现出近亲繁殖的证据。

　　研究人员认为，尽管他们能够发现鼠兔中的遗传变异，不过非侵入性采样仍然具有挑战性。例如，采样过程必须尽量限制非目标DNA的采集，以及需要评估获得的序列，以确保它们来自感兴趣的物种。