Prime95B背照式sCMOS在单分子定位超分辨显微成像中的应用

在前几期成像技术专题中我们向大家介绍了单分子定位超分辨显微成像，并介绍了最适合这一应用的科学相机——背照式 sCMOS 相机 Prime 95B。可能大家心里还是有些疑虑：背照式 sCMOS 真的能够取代 EMCCD 么？信噪比能够达到要求么？

首先，让我们再来复习一下什么是信噪比，还是熟悉的配方：

注：此处的信号为光子数

对于EMCCD来说，电子倍增过程会引入额外噪声因子，这使得除读出噪声以外的其他噪声都会被放大√2倍。因此EMCCD信噪比的计算公式变为：

以看到，虽然电子倍增放大了信号，相当于降低了读出噪声，但是，其实散粒噪声才是大多数时候决定信噪比的关键，它的大小是信号的平方根，当我们忽略其他噪声时：

额外噪声因子的存在相当于将相机量子效率减半！真是成也萧何，败也萧何。

而对于背照式sCMOS来说，既具有和EMCCD相同的95%量子效率，也不存在额外噪声因子，读出噪声又达到了相当低的水平（1.5个电子左右），信噪比在大多数情况下都要高于EMCCD。通过上面公式计算，当信号强度大于5个电子的时候，背照式sCMOS的信噪比就已经超越EMCCD了。更不要说EMCCD还有增益衰减等问题。

接下来我们就来对两者的成像效果进行直观比较，看看Prime 95B 是否真的能够战胜EMCCD。

Prime 95B vs EMCCD

韩国高丽大学的Shim研究组受邀对Prime 95B和 1024x1024 EMCCD 在DNA-PAINT实验中的成像效果进行了比较（图1）。他们使用具有预定义荧光图案的DNA纳米结构 Gattapaint80（ATto655标记，由 Gattaquant 提供）作为标准样品，每个结构选取三个定位点，间隔为80nm；使用647nm激发光，强度约为2kw/cm2，TIR照明，曝光时间20ms，采集超过30000帧图像。

图1 EMCCD（1024x1024）和Prime 95B成像效果对比。两者放大倍数分别为150x和100x ，相机帧率均为50fps。

通过计算，1024x1024 EMCCD的平均定位精度为13.29 nm，而Prime 95B的平均定位精度为9.24 nm，提高了30%。定位精度的模式也显示出相当大的差异，分别为11nm与6nm。

另一位用户对 Prime 95B 与 512x512 EMCCD 进行了比较（图2）：使用Alexa647标记的Gatta Storm 50R纳米尺，每个结构选取两个定位点，间隔50nm；635nm激发光，曝光时间100 ms，采集超过10000帧。

图2 EMCCD（512x512）和Prime 95B成像效果对比。两者均采用100倍放大，EM gain=175；相机帧率均为10fps。

计算得出512x512 EMCCD的平均定位精度为17.98 nm，而Prime 95B的平均定位精度为13.38 nm，提高了25%。定位精度的模式分别为15 nm与12.5 nm

PrimeEnhance Off vs On

上期我们还介绍了Prime系列相机内置的PrimeEnhance功能可以提高图像信噪比。因此Shim研究组也比较了开启 PrimeEnhance 功能前后，Prime 95B的成像效果（图3）

我们看到，当使用 PrimeEnhance 时，定位图像中会出现一些不需要的背景噪声信号（用黄色箭头标记）。通过将分析软件中的强度阈值提高2倍，可以消除这些信号（图4）。

我们还可以从图像直方图分布上看到，开启PrimeEnhance之后，直方图上出现一些细长的“尾巴”，也就是图像伪影，当强度阈值增加2倍时，这些伪影明显被去除（图5）。由此得到的平均定位精度从最初的 9.24 nm增加到 7.47nm，又增加了20%。这表明打开 PrimeEnhance 功能可以进一步提高 Prime 95B 的定位精度。

需要注意的是，当曝光时间为20ms时，启用 PrimeEnhance 会将采集速度降低约40%，但这种差异可以通过使用100ms曝光时间来消除。

根据以上和来自其他许多用户的数据，Prime 95B 以其近乎完美的灵敏度和更优化的像元尺寸，在各种单分子成像中都战胜了EMCCD。而且还具有速度和视野上的巨大优势。此外，Prime 95B内置的处理功能让您在成像时如虎添翼：PrimeEnhance可以进一步提高您的图像质量，从而提高定位精度；PrimeLocate帮您减少每帧采集的数据，减少存储空间，加快数据处理速度。可以说，对于PALM，STORM等单分子定位超分辨显微成像技术来说，Prime 95B是目前最优的选择。

您可以通过下面链接阅读我们在世界各地获得的Prime 95B用户反馈：

Prime 95B应用| 单分子&超分辨成像
Prime 95B应用| 超分辨成像
STORM 超分辨显微成像 – Prime 95B 应用
光子学&STROM显微成像——Prime 95B应用
单分子追踪PALM——Prime 95B 应用
超分辨显微成像——Prime 95B 应用

References

GATTAquant (http://www.gattaquant.com/) for providing the DNA-origami nanostructures.

Abbelight (https://www.abbelight.com/) for providing the imaging buffer.

ThunderSTORM (https://zitmen.github.io/thunderstorm/) which was used to reconstruct and visualize the data.

The Shim Group at Korea University (http://sodaus.wixsite.com/shimku)