QM／MM酶催化反应机制研究

酶反应机理研究是化学、生物学中的核心问题之一，长期以来受到广泛关注。不过酶催化反应研究相当复杂，无论实验还是计算模拟都充满挑战，这主要是因为酶反应过程的多尺度特性[1]： 如图1所示，反应底物化学键断裂与生成、蛋白局部氨基酸残基的运动往往在飞秒到皮秒的时间尺度，若要描述溶剂分子例如水的动力学行为至少需要皮秒时间尺度，蛋白a-helix、b-sheet等二级结构运动周期在纳秒级别，而蛋白(酶)折叠等高级结构形成的时间尺度则更长，位于微秒到毫秒之间。当前，基于经典力学和量子力学的QM/MM组合方法被认为是研究酶催化机理最可靠的计算模拟方法之一，特别是结合分子动力学模拟(MD)后，QM/MM MD模拟能从原子、电子层面深入理解酶反应过程涉及的一系列结构和能量演变等关键信息。QM/MM方法的最初提出者Levitt和Warshel教授，以及在MD领域培养了海量人才的学术大师Karplus教授，共同分享了2013年诺贝尔化学奖。今天以SpnF酶催化机理为例，跟大家分享QM/MM计算在酶催化机制研究中的应用。

图1. 蛋白不同类型运动的时间尺度示意图

图2. SpnF酶中可能的[4+2]与[6+4]环合反应机制

周环反应在有机合成中有广泛应用，许多有机人名反应在自然界中都能找到相关功能的酶[2]，例如，催化[4+2]类型Diels–Alder周环反应的酶相继得到实验报道[3, 4]，理论模拟方面，以SpnF酶为例，Houk团队在早期的气相模拟中揭示了SpnF酶潜在的[6+4]环合分支反应可能性[5]，因而对这类酶是否是单功能的Diels–Alderases，又或者可能存在[4+2]和[6+4]两种环合反应杂泛性的可能，仍然存在争议。近期，Houk团队[6]基于微扰理论的过渡态采样，以及Hess等人[7]基于全酶体系的QM/MM MD计算都阐明了催化[4+2]反应才是SpnF酶的主要活性，尽管的确存在一个[4+2]与[6+4]分支反应共享的过渡态区域，如图2所示。

Hess等人选取了二维反应坐标来开展其QM/MM MD 模拟，QM部分选择的是M06-2X方法，该方法在研究环合反应中广泛使用。他们通过考虑不同大小的QM区域来获得关键氨基酸残基对酶反应的调控作用。如图3所示，随着关键氨基酸残基，如Tyr23, Thr196和Trp256考虑到QM区域，发生[6+4]分支反应的概率逐步下降，这是因为它们与配体的相互作用（氢键和p-堆积），有利于底物处于[4+2]反应活性构象。特别是Thr196效果最为显著，它与底物的作用削弱了C13−C14双键特性从而抑制[6 + 4]反应性，在Thr196Ala突变模拟中，[6 + 4]反应概率提升到90%而在wild type中[6 + 4]环合反应比重仅占到5.6%。计算还发现，即便反应能形成[6 + 4]副产物, Thr196这一关键氨基酸残基也会促进其进一步重排得到最终的 [4 + 2] 产物。而Tyr23/Trp256与底物的p-堆积作用使得C2=C3双键周围电子更加离域。SpnF之所以存在一定概率的[6 + 4] 环合反应，主要是Asn148和Leu198残基对配体的影响，更利于[6 + 4]反应活性。但针对过渡态分支区域开展的详尽的QM/MM MD采样结果表明[4+2]环合才是SpnF催化的主反应（图4）。该论文作者进一步分析提出，与其它已知的Diels−Alderases酶不同之处是, SpnF 酶不仅利用氢键作用，还利用了芳香堆积效应来提高酶反应在[4+2]与[6+4]之间的选择性。这些发现为未来Diels−Alderases蛋白设计提供了重要的理论指导。

图3. 不同QM区域下获得的反应自由能图及其[6+4]产物比重。AàC三个model中关键氨基酸数目逐渐增加

图4. 从过渡态区域出发的QM/MM 非限制性MD 采样结果统计分析。蓝色线代表通往[4+2]产物的反应轨迹，绿色线代表返回反应底物态的轨迹数，红色线代表了[6+4]分支反应的数目

为了研究SpnF酶和水溶液对分叉反应的影响，Houk团队[6]则利用其课题组发展的基于环境微扰的过渡态采样方法（EPTSS），比较研究了在SpnF酶和水溶液中DA反应机理。他们的计算模拟发现，底物分子的过渡态在水和酶不同载体中采取的优势构象有较大差异，研究结果表明在酶SpnF中存在[4+2]与[6+4]的分叉过渡态，并且针对分叉过渡态对比了水与酶环境下[4+2]/[6+4]产物比率，水中为1.6:1.0酶中为11:1，随后他们还详细揭示了酶中关键氨基酸的催化调控作用。最终，他们提出了在SpnF酶反应中，与传统的化学理论中的热力学（thermodynamics）控制与动力学（kinetics）控制不同的观点，认为这是一种全新的蛋白氨基酸“动态学效应”（dynamical effects）所控制的酶催化调控作用。