RAPD（随机扩增多态性DNA）分析技术

RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5'端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3'端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA 5'端方向延伸后再在3'端形成同一引物互补序列的过程。

有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：

（1）5'端带有引物的单链DNA分子在3'端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。

（2）通过两条5'端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。

（3）对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3'端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。

模板DNA

寡核苷酸引物 dNTPs Taq DNA聚合酶 PCR缓冲液 矿物油 电泳所需试剂

PCR扩增仪 电泳装置 微量离心机 微量移液器 Eppendorf管 紫外线观察装置及照相设备

一、 试验条件
 

1.  药品试剂
 

（1）模板DNA（10～100 ng）
 

（2）寡核苷酸引物（20 mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成）
 

（3）0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
 

（4）Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut）
 

（5）10xPCR缓冲液（500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L Tris HCl，pH 8.3）

（6）矿物油
 

（7）电泳所需试剂
 

2.  仪器设备
 

PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器（1～20 ml和20～200 ml）、0.5 ml Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。
 

二、 操作程序

1.  在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物：

水： 14.75 ml

10x缓冲液： 2 ml

10xdNTPs：2 ml

引物（20 mmol/L）：0.2 ml

Taq DNA聚合酶

终体积

DNA（10～100ng）：1 ml

石蜡油 ：20 ml
 

2.  93℃反应2 min后开始如下循环：

93℃变性反应：1 min

36℃退火反应：1 min

72℃延伸反应：1.5 min

经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5 min，循环结束后反应产物置于4℃保存。
 

3.  20 ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

一、应注意的问题及解决办法

1.  扩增偏差或无扩增。

（1）在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。

（2）PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。

（3）在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。

（4）稀释新的DNA溶液。

（5）引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。

（6）延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。

（7）提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。

（8）补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。

2.  扩增结果差，条带模糊或难以辨认。

（1）更换Taq聚合酶缓冲液。

（2）检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16% 6 mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。

（3）检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。

（4）改变DNA浓度。

3.  高相对分子质量产物弥散状分布>4 kb。

（1）降低DNA浓度。

（2）降低Taq聚合酶浓度。

（3）减少凝胶上样量。

（4）可能是由于循环数过多的结果（Bell和Demarini 1991），减少循环数。

（5）确认是否使用正确的缓冲液（不是水！）制备凝胶。

（6）在较低的电压下电泳。

4.  对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。

确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。

5.  带谱不可重复。

DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100 ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。只考虑主要条带。

6.  染色后凝胶背景太强影响分辨率。

（1）减少染色时间。

（2）凝胶脱色时间延长。

（3）PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。

7.  低相对分子质量产物分离不充分。

在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。

1. RAPD主要有以下的自身特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9——10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。

2.  RAPD分析的优越性和不足，RAPD是一种全新且有效的遗传标记，与其他分子标记相比，具有许多优越之处：①合成一套引物，可用于不同生物基因组的分析。相对来说，RFLP标记具种族特异性，这限制了其应用。②RAPD技术简便易行，省力省时。不需要RFLP分析的预备工作，如克隆制备、同位素标记、Southern印迹和分子杂交。并且RAPD检测灵敏方便，用荧光染料或同位素标记均可检测，这大大增加了其分析速度。即使用序列胶来分析RAPD，单独一人仅用36小时便能完成120个样品的分析，而RFLP至少要花一周时间。③RAPD分析所需样品DNA量极少。仅为RFLP的1/1000-1/200，这对于生物早期取样鉴定或DNA受限制的情况大有益处。④由于RAPD用于构建基因图谱时不需要克隆，这可打破克隆载体和宿主的限制，扩大了应用范围。⑤每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，这对共同协作的研究项目，可简化信息的转移过程。⑥RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。⑦RAPD分析能自动化，减少了象RFLP那样的麻烦手续。