1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。
直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过 大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。
在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
RNAi的作用机制RNAi作用机制图解（以线虫中的三种不同形式为例）
体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的 mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的 dsRNA 片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而 mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等 RNAi相关的基因。