八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
注：
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
两步法RT-PCR
（第一步：逆转录反应）
试剂 浓度 体积 终浓度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀释10倍后用）
↓
混匀，离心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
试剂 浓度 体积 终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl（20μl）
↓
混匀，离心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破坏MLV）
↓
4℃保存
两步法RT-PCR
（第二步：PCR反应）
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X